写在前面

今天写一写聚类图的绘制，因为作者这是个对生信感兴趣的非生物学本科生；再加上我一直认为像我这种靠兴趣学习的小白，从分析过程入手进行学习会有趣些，所以这次内容可能会偏向于操作，具体的原理可以看看其他大佬的。

系统发生数数据的获取

系统发生数的构建主要是基于SNP进行，其具有距离矩阵法、最大似然法、最大简约法和贝叶斯法，其中距离矩阵法中的邻接法为一种常见的方法（各方法具体的原理可见其他大佬的推文，或者等我学完来写写）。
为了省时又便于理解，我们通过tassel5进行获取数据

• 将SNP数据导入tassel5软件
• analysis-relatedness-creat tree 进行构建系统发生树
• 在返回的文件上选择results-archaeopteryx tree可以康一康构建出来的树
  

但是，这图明显不好看啊，和我在文章里面看的完全不一样啊

系统发生树数据的导出

在analysis-relatedness-creat tree结果文件导出为newwick格式

系统发生树的美化

方式一：通过iTOL平台

网址如下：https://itol.embl.de/

自己玩泥巴去吧（自己摸索摸索，很简单来着）

方式二：通过R package-ggtree

ggtree 是Guangchuang Yu（人称Y叔）构建的系统发生树构建的R package，这是ggtree的主页https://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/ggtree/inst/doc/ggtree.html

1、安装package-ggtree

#the first way
install.packages("ggtree")
#一般情况下rstudio默认的源里面是找不到ggtree
#因此可以通过BiocManager下载
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("ggtree")

下载完成后library()一下看一下安装完成否

2、读取.new数据

library(stringr)
library(ggtree)
library(treeio)
tree<-read.tree("tree.nwk")
ggtree(tree,branch.length = 'none',layout = 'circular')+
  geom_tiplab(size=1)

可以看到ggtree的绘制格式类似于ggplot2

3、具体参数介绍

#颜色大小类型等设置类似于ggplot2
ggtree(tree, color="firebrick", size=2, linetype="dotted")
#发生树默认以阶梯状排列，可以自行控制
ggtree(tree, ladderize=FALSE)

系统发生树的类型可以自定义

ggtree(tree, layout="roundrect")
ggtree(tree, layout="slanted")
ggtree(tree, layout="ellipse")
ggtree(tree, layout="circular")
ggtree(tree, layout="fan", open.angle=120)
ggtree(tree, layout="equal_angle")
ggtree(tree, layout="daylight")
ggtree(tree, branch.length='none')
ggtree(tree, layout="ellipse", branch.length="none")
ggtree(tree, branch.length='none', layout='circular')
ggtree(tree, layout="daylight", branch.length = 'none')
#具体效果见下图，更多的效果可以通过设置坐标等进行更改

进化树的组件

#通过geom_treescale()控制
ggtree(tree)+geom_treescale()
#其中参数为
ggtree(tree) + geom_treescale(x=0, y=45, width=1, color='red')
ggtree(tree) + geom_treescale(fontsize=6, linesize=2, offset=1)
#xy控制数的比例位置
#width控制树宽度
#fontsize控制文本大小
#linesize控制线大小
#offset控制文本偏移量
#color控制文本颜色

#通过theme_tree2()添加树的X轴
ggtree(tree) + theme_tree2()

#通过geom_nodepoint()显示内部节点
#通过geom_tippoint()显示外部节点
ggtree(tree) + geom_point(aes(shape=isTip, color=isTip), size=3)

#geom_text()控制显示节点和提示标签
#geom_label()控制显示节点和提示标签
#geom_tiplab()控制显示提示标签
ggtree(tree, layout="circular") + geom_tiplab(aes(angle=angle), color='blue')
#见下图B

#geom_rootedge()控制显示根边
ggtree(tree1) + geom_tiplab() + geom_rootedge()
#通过aes(color=)控制颜色

系统发育树注释

#具体参数如下
Layer   Description
geom_balance    highlights the two direct descendant clades of an internal node
geom_cladelabel annotate a clade with bar and text label
geom_facet  plot associated data in specific panel (facet) and align the plot with the tree
geom_hilight    highlight selected clade with rectanglar or round shape
geom_inset  add insets (subplots) to tree nodes
geom_label2 modified version of geom_label, with subsetting supported
geom_nodepoint  annotate internal nodes with symbolic points
geom_point2 modified version of geom_point, with subsetting supported
geom_range  bar layer to present uncertainty of evolutionary inference
geom_rootpoint  annotate root node with symbolic point
geom_rootedge   add root edge to a tree
geom_segment2   modified version of geom_segment, with subsetting supported
geom_strip  annotate associated taxa with bar and (optional) text label
geom_taxalink   Linking related taxa
geom_text2  modified version of geom_text, with subsetting supported
geom_tiplab layer of tip labels
geom_tippoint   annotate external nodes with symbolic points
geom_tree   tree structure layer, with multiple layout supported
geom_treescale  tree branch scale legend

因内容过多，具体内容可见 Data Integration, Manipulation and Visualization of Phylogenetic Trees，反正我直接偷跑先开始学了~

喜闻乐见碎碎念

今天又帮对门兄弟提了一天RNA，我一不看着他就做错好几步，分明是来帮实验的倒是变成教实验的。不禁感慨，和你做实验像坐牢（笑死）
这个兄弟后续会测定RNA浓度、qPCR，趁着在实验室“坐牢”，就问了问怎么设计引物，抱着该死的好奇心，我花了一晚上整明白了（芜湖）

引物设计要求

搬运自其它博主

• 长度15-30bp
• CG含量40-60%
• 引物模板序列Tm 72℃最佳，至少55-80℃
• 3'端引物一般不使用A
• 避免3'端出现3个碱基重复
• 等等

引物设计软件

Primer Premier 6
请自行下载（去微信搜搜或许是个好方法）

分析步骤

1.下载基因序列数据

通过NCBI下载基因数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

在搜索框输入对应基因名称检索基因序列数据，这里我们使用Arabidopsis thaliana NRT1.1 基因，其为拟南芥中硝酸盐转运蛋白基因，下载序列。

通过Primer Premier设计引物

• 打开Primer Premier 6 软件
  

• 在file-open-sequence打开下载的基因序列，打开效果如上图

• 选择 analyze-primer search

• 在弹出的设置页选择primer parameters对参数进行设置
  

• 1.其中Tm为熔融温度

• 2.Ta 为退火温度（应该）

• 3.amplicon lenght 为产物长度

• 4.alternate primer pairs为可替换碱基对
  其中最重要的为熔融温度

• 点击serch返回检索得到的引物序列，默认显示best 的引物序列
  
  其中会显示引物的rating和引物的具体信息，包括引物序列、位置、长度、Tm值等信息。在右上的序列图上会显示扩增序列序列位置

• 右击引物序列选择all primers返回可选择的引物序列列表及其信息，点击all structure可以显示其结构，根据需要选择合适的引物序列点击replace选择替换

引物序列验证

选择的引物序列需要进行验证

• 在NCBI主页上选择blast后选择primer-blast
  
• 在use my own foraward primer框后输入先引物序列，其序列可以右键引物后选择copy sense primer复制
• use my own reverse primer框输入后引物序列，其可以右键copy anti-sense primer复制
• 在organism输入需要扩增的物种名称
• 点击get blast获取报告
  -读取报告
  
  primer-blast选择只有一个基因NRT1.1与引物序列匹配，特异性挺好，就他了。

完毕

接下来把序列交给公司就搞定了

芜湖，好奇心满足了

写在前面

作为一位热心市民，今天去帮对门好兄弟做了个提取培养细胞RNA的实验。虽然对于大部分同学来说，这个实验很简单来着，但是我得写一写以免一天摸鱼无所事事（狗头）。

实验设计

对门好兄弟的实验是观察到根系一类菌在某一节点具有两种代谢途径，便打算通过测定两种代谢途径下游的RNA的表达，来从经济角度考虑其生存策略。在处理后在不同时间段采样以分析RNA表达随处理时间的变化，其包含近30个测定指标（RNA），通过qPCR对表达量进行定量。

RNA提取试剂盒

使用的试剂盒为TIANGEN的RNA提取试剂盒，主要成分如下：

• 裂解液RL（Buffer RL）：主要功能为裂解细胞
• 去蛋白液RW1（Buffer RW1）：主要功能为洗去蛋白质
• 漂洗液RW（Buffer RW）：用于漂洗（这不是没说？）
• 无RNA酶双蒸水（RNase-Free ddH2O）
• RNase-Free吸附柱CR3（RNase-Free Columns CRS set）
• RNase-Free过滤柱（RNase-Free Columns Cs set）
• RNase-Free DNase I：DNA 的消化液
• RDD缓冲液：DNA消化缓冲液
• RNase-Free离心管

所有试剂盒提取RNA 的原理大同小异，都是通过裂解液裂解细胞后通过过滤柱，在乙醇下DNA、RNA固定与吸附柱，再进行漂洗、去掉蛋白等过程；之后加入DNase去掉DNA得到RNA。

注意事项

最重要的就是预防RNase的感染，不然哦，白忙活哦！

• 建议带个口罩操作哈
• 多换手套
• 别省那点枪头哈
• 使用RNase-Free的水，别乱加就行

实验步骤

• 取出细菌样品，在室温下融化
• 在细菌中提前加入β-巯基乙醇；
• 轻弹离心管底部（经验步骤），加入350ul RL Buffer（一般细菌量不多就加这么多）
• 旋震荡10s，室温培养10min，其中每2min旋涡10s
• 所有溶液转运至过滤柱CS上，12000rpm下离心2min
• 向滤液加入350ul（经验数值） 70%乙醇，混匀后转移入吸附柱CR3，12000rpm下离心2min后倒掉滤液
• 向吸附柱加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min后倒掉滤液
• 配置DNase工作液，DNase I与RDD缓冲液体积比为1:7；根据要进行的个数配置工作液（一般可以配置所需溶液的1.2倍）
• 向吸附柱中央（尽量滴到中央哦）加入80ul DNase工作液，室温放置15min
• 向吸附柱中加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min，弃去滤液
• 向吸附柱加入500ul漂洗液RW（RW实现加入酒精）后室温静置2min，12000rpm下离心2min后弃去滤液。这个过程重复2次
• 12000rpm下再离心2min后弃去滤液，打开离心管盖室温放置数分钟以除去残余漂洗液以免对RT等测定产生影响
• 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管，加入60ul（选择范围30-100ul，推荐分两次加入）RNase-Free ddH2O后室温放置2min，12000rpm下离心2min，滤液即为RNA
• 如果要对RNA保存，请于-70℃环境保存

哦，这该死的好奇心

写在最前面

大三上的时候上了一门课《全球变化生物学》，老师讲的挺有趣，我也十分感兴趣，就在课外阅读写相关文献，邻近期末了发现这些看过的文献竟然可以按照自己的理解串成一个故事，就试着写一写。

摘要

为了大家省时间快速康康我葫芦里在卖什么药，我直接上一份摘要。
在全球气候变暖的背景下，全球干旱呈现出更频繁、更持久的特点。而植物对于干旱胁迫具有“记忆”行为，这种行为的机理可能与信号物质的积累以及表观遗传的变化有关。这种记忆行为从个体上提高个体存活，通过雄性不育控制后代性别从而促进群体的存活，而我们可以通过育种、沟灌等方式利用植物的胁迫记忆。

一、全球气候变化背景

在人类的整个历史进程中，地球的气候都在不断发生变化，而这种气候变化的原因大多归于地球轨道上的微小变化。但是目前全球气候变暖的趋势具有与众不同的意义，其原因在于大量的证据表明，现代全球气候变暖现象很大可能源于19世纪中期以来的人类活动。根据NASA以及IPCC的第五次气候评估报告，全球温度自1880年观测升高了2.0℉；二氧化碳比例于工业革命前提高了47%（自185ppm升高到280ppm）。其结果导致了北极冰川以每十年13.1%的速度下降；南极冰盖以每年1490亿吨的质量流失；海平面以每年3.3mm的速率上升(Lindgren, 2014)。
对于全球农业生产，全球气候变暖的同时导致了全球极端气候发生的频率和强度增加，植物将面对更为严重和频繁的包括高温、干旱在内的气候胁迫。在这些胁迫之中，对于农业生产最为重要的胁迫为干旱胁迫。随着全球气候的变化，干旱胁迫一方面逐渐频繁；另一方面由于全球气温的增加，干旱的恢复周期不断增长（图1）。也就是说，植物必须面对更加频繁和持久的干旱胁迫。

关于这个干旱缺水，NASA做过一个美国的动图和预测，因为这里放不了动图，有兴趣的读者可以去搜搜。

二、植物干旱胁迫记忆

在关注全球干旱胁迫的同时，我们观察到植物对于干旱胁迫具有的“记忆行为”。在干旱胁迫中，我们注意到一些受到过干旱胁迫的植株，与未受到过干旱胁迫的植株相比，在下一次干旱胁迫来临时呈现出截然不同的表现（为受过胁迫的植株易萎蔫，而受过胁迫的植株正常生长）(Kinoshita & Seki, 2014)。植物的这种行为与人类的记忆呈现出一定的相似性，为了进一步探究这种有趣的现象，有研究对植物进行的持续的、间或的干旱胁迫。通过对野生拟南芥进行干旱胁迫，再进行浇水恢复生长，其中拟南芥的分离出正常生长与“迟缓生长”两种状态，进一步的，对“迟缓生长”的拟南芥表型施加持续不断的干旱胁迫和恢复，发现其与正常生长的拟南芥即使在相同生长条件下也呈现出了截然不同的生长状态，经过不断胁迫的拟南芥植株表现为“迟缓生长”的状态(Peter A. Crisp，Diep Ganguly, 2016)（图2）。
科学奖们将植物的这种类似于人类的记忆的植物生长行为称为植物胁迫记忆（plant stress memory），而这种有趣的植物生长现象背后的机理是所有植物研究工作者所关注的。

三、干旱胁迫记忆机理

1.胁迫记忆信号的积累

植物现状与植物基因的相关性已被揭示，为了研究干旱胁迫背后的机理，研究将重点指向了植物干旱胁迫响应过程中的基因表达的变化。通过培养经过不同干旱胁迫周期的拟南芥植株，在表型上观察到植株的保水性状随着干旱胁迫“训练”周期数的增加而不断增强（图3a、b）。因此，研究选取了与植物保水性状有关的代表性基因（RD29A、RD29B、COR15A、COR18），通过分析其在不断胁迫过程中的基因表达变化，得到RD29A、COR15A在不断的胁迫与恢复过程中呈现为震荡的状态（图4a、b）；而RD29B、COR18在不断的胁迫和恢复过程中呈现为逐渐波动上升的状态（图4c、d）。研究证明在植物干旱胁迫记忆的建立过程中，植物的某些基因的表达也形成了记忆机制(Ding, Fromm, & Avramova, 2012)。


在植物免疫记忆的研究中，发现了一类“信号放大器”，在植物产生免疫防御响应后再植物体内合成积累，当下一次免疫防御发生时，植物的免疫信号通过“信号放大器”进行快速传递和放大，使得植物体快速建立免疫防御(Conrath, 2011)。类比于植物免疫记忆的机理，研究对植物干旱胁迫记忆建立过程中的各种代谢物与转录因子进行了测定，发现在植物干旱胁迫的过程中，各种转录因子和基因都表达上升，而随着水分条件的改善，进入恢复期，大部分转录因子的表达回归到胁迫前，而一类持久调节的关键信号代谢物和转录因子在植物胁迫记忆的过程中持续保持的较高水平(Peter A. Crisp，Diep Ganguly, 2016)（图5）。因此，我们猜测在植物通过相关基因中间信号物质（或类似于“信号放大器”）的积累，实现了植物对于频繁干旱胁迫的快速响应和记忆。

2．表观遗传的变化

在对拟南芥的干旱胁迫实验便已发现，这个胁迫记忆具有一定程度上的可遗传性，对于环境引起的可遗传的性状，一个常用的解释方向便是表观遗传。因此研究开始关注表观遗传与干旱胁迫记忆的关系。
基于这个前提和假设，在对拟南芥的保水性状基因的研究上更近一步，使用一类组蛋白H3K4me3的甲基转移酶atx1，抑制组蛋白上的甲基化过程。通过实验发现，两类基因的表达量都发生了显著降低(Ding et al., 2012)（图6），这可以说明表观遗传过程（或者说甲基化过程）参与到了与胁迫记忆有关的基因的调控中。

在这时，MSH基因的发现，为研究植物干旱胁迫记忆提供了全新的工具。在植物干旱胁迫的过程中发现了MSH1基因的表达显著变化，随着进一步的研究发现MSH1对控制叶绿体和线粒体的基因温度性具有重要作用，且这种作用是通过控制叶绿体和线粒体基因的表观遗传实现。通过使用Ti质粒插入msh1基因（msh1-TDNA）、对msh1基因进行基因沉默（msh1-RNAi）构建拟南芥，与野生型（WT）以及具有胁迫记忆的拟南芥（msh1-memory）进行比较，通过测定发现在具有胁迫记忆的拟南芥植株中，msh1的表达显著降低（图7a、b）；更近一步，通过5-氮杂胞苷（DNA甲基化的一种抑制剂）处理上述的四类拟南芥植株，发现由msh1表达差异导致的表型差异（叶面积）消失（图7c、d），至此确认MSH1记忆通过甲基化作用影响植物干旱胁迫记忆(Yang et al., 2020)。

经过一系列的研究，科学家给出了MSH1控制表观遗传的机理，即外界胁迫（如干旱）抑制MSH1基因表达，从而导致线粒体内基因的DNA重排，分泌PEP至叶绿体，叶绿体产生WHY1至细胞核，细胞核接受信号介导细胞核的DNA甲基化（图8），从而使得植物在表观遗传上做出响应。(Mackenzie & Kundariya, 2020)

3.其他机理

除去信号物质的积累和表观遗传变化，植物干旱胁迫记忆或者广义上的植物胁迫记忆涉及到如植物激素、FLC基因（图9），这里便不进行展开。(Peter A. Crisp，Diep Ganguly, 2016)

四、干旱胁迫记忆的意义

植物建立的干旱胁迫记忆，一方面，使得其叶面积减少、保水能力增强，提升其在多变气候条件下的生存能力；另一方面，有研究指出干旱胁迫记忆的产生可以会对植物的生殖产生影响，从而提高整个群落在不稳定环境的生存能力。
这一作用过程可能涉及到MSH1基因的表达，且最先在烟草中观察到。通过基因沉默技术构建MSH1基因沉默的烟草，通过电泳验证了两者在MSH1基因表达上的差异，实验得到MSH1基因沉默的烟草植株生长功能受到抑制而导致雄性不育（图10）(Ajay Pal S. Sandhu, 2007)。在拟南芥的研究中也发现MSH1基因抑制而导致的雄性不育(Mackenzie & Kundariya, 2020)，这种对于胁迫的响应，我们将其理解为群体为了适应不稳定且恶劣的自然环境，而减少后代中的雄性个体，增加雌性个体，以增强后代群体的生殖能力，以便于整个群体的存活。

五、胁迫记忆的应用

1.利用MSH1基因选育雄性不育材料

随着现代生物技术的快速发展，利用基因工程选育雄性不育材料已经成为了植物雄性不育研究的热点之一。目前已知的雄性不育都是由于线粒体基因组的基因异常所致，而MSH1就是维持线粒体基因组稳定性的重要基因之一，因此通过控制MSH1基因的表达，理论能够实现对后代雄性不育的控制，加之这种技术可以得到稳定遗传的后代，在杂交种制种上具有可观的应用价值。

2.增强植物适应能力

有研究已经指出，通过将野生植株与MSH1表达抑制的植株体作为砧木（即具有胁迫记忆的植株）进行嫁接，得到的植株具有更高的活力（图11），且这种活力可遗传而可以扩大到田生产(Kundariya et al., 2020)。

3.指导农业生产

在农业生产中，沟灌是常常使用的一项沟灌技术，而干湿交替沟灌（SWDFI）、固定干湿沟灌（FWDFI）与传统沟灌法（TFI）相比（图12）具有更好的效果而被广泛采用，而其原理都为人为的制造局部干旱胁迫。有研究指出，干湿交替沟灌与传统沟灌相比在相同的灌溉水平下具有更高的产量和品质，且植物的水利用效率更高(Sarker et al., 2016)。

参考文献

Ajay Pal S. Sandhu, R. V. A., and Sally A. Mackenzie. (2007). Transgenic induction of mitochondrial rearrangements for cytoplasmic male sterility in crop plants. PNAS, February 6, 2007 104 (6) 1766-1770.

Conrath, U. (2011). Molecular aspects of defence priming. Trends Plant Sci, 16(10), 524-531. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21782492. doi:10.1016/j.tplants.2011.06.004

Ding, Y., Fromm, M., & Avramova, Z. (2012). Multiple exposures to drought 'train' transcriptional responses in Arabidopsis. Nat Commun, 3, 740. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22415831. doi:10.1038/ncomms1732

Kinoshita, T., & Seki, M. (2014). Epigenetic memory for stress response and adaptation in plants. Plant Cell Physiol, 55(11), 1859-1863. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25298421. doi:10.1093/pcp/pcu125

Kundariya, H., Yang, X., Morton, K., Sanchez, R., Axtell, M. J., Hutton, S. F., . . . Mackenzie, S. A. (2020). MSH1-induced heritable enhanced growth vigor through grafting is associated with the RdDM pathway in plants. Nat Commun, 11(1), 5343. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33093443. doi:10.1038/s41467-020-19140-x

Lindgren, M. (2014). Climate Change 2014 Synthesis Report Summary for PolicymakersChapter. IPCC, AR5.

Mackenzie, S. A., & Kundariya, H. (2020). Organellar protein multi-functionality and phenotypic plasticity in plants. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 375(1790), 20190182. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31787051. doi:10.1098/rstb.2019.0182

Peter A. Crisp，Diep Ganguly, S. R. E., Justin O. Borevitz and Barry J. Pogson. (2016). Reconsidering plant memory: Intersections between stress recovery, RNA turnover, and epigenetics. Science Advances, Vol. 2, no. 2, e1501340.

Sarker, K. K., Akanda, M. A. R., Biswas, S. K., Roy, D. K., Khatun, A., & Goffar, M. A. (2016). Field performance of alternate wetting and drying furrow irrigation on tomato crop growth, yield, water use efficiency, quality and profitability. Journal of Integrative Agriculture, 15(10), 2380-2392. doi:10.1016/s2095-3119(16)61370-9

Yang, X., Sanchez, R., Kundariya, H., Maher, T., Dopp, I., Schwegel, R., . . . Mackenzie, S. A. (2020). Segregation of an MSH1 RNAi transgene produces heritable non-genetic memory in association with methylome reprogramming. Nat Commun, 11(1), 2214. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32371941. doi:10.1038/s41467-020-16036-8

这里写写摘要

本文通过梯度稀释法产生了不同微生物多样性的细菌群落，并通过测序研究生物多样性与群落装配、群落功能的影响，并推测其潜在的功能性状。通过系统发育零模型分析，表明了随机装配在高多样性群落中的主导地位；低多样性群落中确定性装配的主导地位，同时这种确定性装配导致了特定功能的丢失，从而限制了群落功能。

实验背景

由于土壤微生物复杂以及难以培养的特性，使得对微生物多样性与生态功能的研究十分困难，自Whittaker提出生物多样性的概念后，为土壤微生物的研究提供了全新的研究思路。随着不断的研究，越来越多的证据已经指出，微生物的α多样性（即样本群落内的生物多样性）对生态系统的功能具有重要作用，而对于β多样性（即多个样本群落间的生物多样性）的影响关注较少，事实上β多样性对于推断土壤生物的群落装配过程是随机性还是确定性的具有重要意义。
微生物群落是陆地生态系统的重要组成部分，微生物的活动极大地影响了生态系统的功能及其稳定性。在生态学上，具有一个普遍的假设，即包含众多物种的生态系统具有高度的稳定性和生态系统功能，基于此提出物种功能的重叠为生态系统的稳定性提供了一些冗余与缓存，但是即便如此，我们对于和多样性有关的细菌群落如何相互作用调节生态系统功能和群落装配所知甚少。
在自然条件下，微生物群落的生长受到各种因素的影响，根据研究指出，土壤微生物多样性受到pH、土壤类型、纬度、植被、湿度、温度和养分的强烈影响，其中pH值是土壤多样性和丰度最佳的预测指标。一般来说，我们将土壤微生物多样性和功能的产生称为群落装配过程，其过程反映了群落组成的时空聚集过程，可以分为确定性和随机性过程。
基于已有的研究，本研究从微生物多样性出发，通过改变土壤微生物的多样性，分析其群落结构的组成和丰度差异（α多样性），进而观察生物多样性的不同对生态系统功能的影响；同时通过不同生物多样性的微生物群落结果的比较（β多样性）尝试分析土壤微生物的装配过程。

论文思路和方法

论文思路

通过将不同稀释浓度的土壤浸出液接种到灭菌处理的不同pH培养基，人为制造土壤微生物生物多样性的差异，培养16周后进行测序。先通过香农多样性（衡量α多样性的一种参数）观察不同处理的多样性差异；之后在影响微生物多样性的因素中选取具有代表性的pH、土壤类型、养分因素，进行变异分析，寻找导致多样性差异的主要因素。再通过|βNTI|（衡量β多样性的一种参数）比较不同处理间的差异，进而分析其群落装配过程是否为随机性装配过程。最后分析与生态系统功能有关的各类基因的表达差异，尝试分析微生物生物多样性的不同是否导致了生态系统功能的不同。即文章以以下思路展开：人为稀释显著降低生物多样性；生物多样性的降低触发了群落的确定性装配；群落的确定性装配会在一定程度上影响微生物群落的生态系统功能

实验方法

1.土壤选取和实验处理

移取土壤稀释液所用的土壤分别为黑土与红壤，按照土壤分类，其分别为钙质黑钙土、铁铝始成土（具体原始土壤土壤参数见下表1）。两种土壤一部分经过2mm筛后与室温下维持于恒定水分（田持30%），另一部分通过γ射线消毒。无菌土壤进行预实验，确定调节pH所需的CaO、FeSO4量。通过20g新鲜土样与180ml无菌水得到10-1稀释浓度，根据10-1稀释浓度稀释液得到10-4、10-7、10-10稀释梯度（图1），同时通过CaO、FeSO4获得pH梯度4.5、5.5、6.5、7.5、8.5（具体使用量见下表2）。共252个水平，其中5个pH处理×4个稀释处理×2个土壤类型+2个初始土壤处理，每个土壤处理6个重复。于20℃、45%田持条件下培养，每两周测定pH与Ca、Fe、SO4浓度，共培养16周。

表1：实验用原始土壤的土壤参数

土壤类型	pH	有机质%	N mg/kg	P mg/kg	K mg/kg
黑土	8.0	4.6	100.8	16.7	90.5
红壤	5.3	1.6	53.9	0.95	61.5

2.DNA提取和测序

培养16周后进行DNA提取，采用提取试剂盒，每个处理取两个重复，即三个重复提取DNA进行混合以最大限度减少误差。先在分光光度计260/280nm与260/230nm波长下评估提取DNA的质量。将通过评估的提取DNA在引物作用下进行PCR扩增，采用的16S rRNA扩增技术，对扩增细菌的16S rRNA V4高变区域进行扩展测序。测序数据进行质控后以97%的相似性进行聚类形成OTU以便后续分析；而其基因功能通过比对基因数据库进行基因功能注释。

3.数据分析

基于测序得到的OTU表，通过计算机程序得到香农多样性与NMDS分析；综合测定的pH、Ca、Fe、SO4浓度可以进行VPA（方差分解分析）得到土壤类型、pH、Ca、Fe、SO4浓度对于细菌群落变化的贡献。不同处理的比较（β多样性的比较）通过Unifrac方法进行（使用邓肯方法进行显著性比较），但为了推断群落的装配过程，引入参数βNTI，其中|βNTI|<2表明所观察到的系统发育组成的差异是随机过程的结果。基因功能的比较采用构建相对丰度的热图，数据来源于红壤的宏基因组测序，其中相对丰度指的是隶属于该功能组的序列数除以每个样本的总序列数，其结果以热图显示。

实验结果

1．重新组装细菌群落的系统分类特征

稀释对于重新装配细菌群落的组成具有显著的影响（图2a、b），同时pH对群落的组成也具有一定影响，在基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度(NMDS)中，不同稀释浓度的土壤群落在横坐标上分离，而不同pH的土壤群落在纵坐标上分离（图2a），表明稀释与pH对土壤微生物群落的重新装配具有最为显著的影响。将pH与稀释浓度作为横纵坐标的香农分析得出，香农多样性随着稀释浓度的增加而降低；而pH上，香农多样性在pH为中性的条件下处于较高水平（图2b）。

对不同pH下的黑土与红壤进行加权的UniFrac群落相异度分类分析得出两种土壤都在不同稀释浓度下表现出较大差异，且随着稀释浓度的增大，差异也随之增大（图3a）；以土壤类型进行比较得出不同土壤类型在不同稀释浓度上也存在着较大差异（图3b）。到此说明了虽然稀释的影响细菌群落结果的最大因素，但是pH与土壤类型对其也具有一定的影响。
通过变异分解分析（VPA）对土壤类型、pH与Ca、Fe、SO4浓度对于群落结构差异的相对贡献进行评价（图3c-h）。随着稀释浓度的增大，土壤类型的贡献逐渐降低；而pH的影响逐渐增大；Ca、Fe、SO4浓度的影响较小，可以忽略。

2．细菌群落的装配过程

为了辨别随着稀释浓度与pH梯度变化，群落中的确定性与随机性变化，引入参数βNTI。通过|βNTI|与稀释梯度与pH梯度的关系（图4a-d），可以得到，群落装配过程随着稀释梯度水平的增加，逐渐从随机性过程(|βNTI|>2)向确定性过程（|βNTI|<2）转变，并且中性条件（pH6.5）下其向多变性的确定性装配过程转变（即|βNTI|>2,
系统发育周转率高于预期）；其他pH条件下向均一化的确定性装配过程转变（|βNTI|<2，系统发育周转率低于预期）。将香农多样性与|βNTI|进行相关性分析，得到两者呈现负相关，即微生物多样性低的情况下，土壤微生物趋向于确定性装配过程。

3．重新装配细菌群落的潜在的功能

为了评估各处理的生态功能，对红壤样品提取通过鸟枪法进行宏基因组测序，选取与生态系统有关的一些基因，测定其相对表达丰度。在选定的基因内，一部分基因分布在特定的微生物，如与“硫代谢”“氮代谢”等有关的“特异性功能基因”，我们暂且将其称为FunGP1,。这类基因大部分随着稀释梯度的增加而显著降低；而另一类具有广义功能定义（如“TCA循环”、“糖酵解”有基因）的基因（暂且称为FunGP2）随着稀释梯度的增加，其相对表达量显著升高。（图5a）。尽管FunGp1和FunGp2的相对丰度存在这些相反的模式，各功能类群的多样性随稀释程度的增加呈下降趋势（图4b），且相较于FunGp2(图4c),FunGp1(图4b)的功能多样性下降幅度更大。
为了进一步研究细菌多样性的影响以及确定性或随机性装配过程对代谢功能的相对丰度(FG RA）与多样性（FG Div）的影响，通过计算|βNTI |及其对应的香农多样性指数、FG RA与FG Div之间的相关性(图5d)。发现FunGp1的功能性状多样性和相对丰度、FunGp2的功能性状多样性与Shannon多样性呈正相关，与|βNTI |值呈负相关；而FunGp2的功能性状相对丰度则与Shannon多样性呈负相关，与|βNTI |值呈正相关。

4．细菌群落装配过程的概念模型

综上所述，我们可以看到，随着认为的制造稀释梯度与pH梯度，使得土壤微生物多样性随着稀释梯度的增加而降低，这种微生物多样性的降低使得土壤微生物在重新装配的过程中去趋向于确定性装配过程。而观察这个过程中的基因变化，我们可以发现，随着确定性的装配过程（即低水平的微生物多样性），具有广义功能定义的基因相对表达升高，而具有特异性功能定义的基因相对表达下降，这种结果可能会在一定程度上限制土壤微生物的生态系统功能。

基于这个研究，提出了细菌群落装配过程的概念模型（图6），其解释了与微生物多样性相关的确定性或随机性装配过程如何在不同pH条件下促进细菌群落的结构和功能的装配。

第一部分:高多样性的群落装配。在高生物多样性的阶段内，土壤中含有大量复杂且无法被大多数微生物利用的底物，当环境中的营养物质不足以支持大量微生物时，竞争加剧，而包含“硫代谢”、“氮代谢”等特异性功能的微生物群落，对于分解土壤养分，维持土壤养分循环而潜在地削弱生物竞争起到了重要作用。

第二部分：pH中性土壤中低生物多样性群落装配。在中性环境中大部分微生物都可以生存，这便导致了栖息地对于微生物的选择作用减弱。低多样性导致的特异性功能的丢失可能会导致一定程度上的土壤养分代谢减弱，从而增加生物竞争。总体而言，这时候的装配过程更可能是由当时的环境条件所决定，所以表现为多变的确定性装配过程。
第三部分：酸性、碱性条件土壤中的低多样性群落装配。在土壤pH变的极端的条件下，环境对于微生物群落的选择作用大大增强，从而发生同质选择，使得广义的功能基因表达占主导

通过模型的结果表明，在低多样性的群落中，特异性功能类别的相对丰度降低，而广义性功能类群的相对丰度有所增加。这种情况导致在细菌多样性较低的群落装配中确定性装配过程占主导地位。然而，在高多样性群落中，特异性功能的存在导致了群落的随机性装配过程占优势。

扩展

1．生物测序方法

（1）16S rRNA扩增子测序

扩增子是一段DNA或RNA，是扩增或复事件的来源，通过扩增子的扩增，大量增加某段DNA的含量。微生物扩增子测序中常用的扩增子是16S rRNA基因，其为编码原核生物核糖体小亚基的基因，大小适中，具有9个可变区域和10个保守区域，通过保守区域可以反映物种间的亲缘关系，而可变区域可以体现物种间的差异。在基因的可变区域内，V4区域特异性较好，数据库信息全，因此一般选择V4区域进行扩增子测序（本文即选择V4区域）。

进行扩增子测序的步骤（图7）在于先在特殊引物的作用下通过扩增技术（PCR或LCR），扩增扩增子的数量再进行定量，在实验过程中，也会先将扩增出的大量扩增子进行串联后进行测定，定量方法可以采用RT-PCR以及DNA测序技术（如next-generation sequencing）。

（2）高通量测序

高通量测序也被称作下一代测序或第二代测序，是大规模并行测序方法。其测序步骤一般按照以下过程：首先，通过体外的PCR扩增DNA测序文库；再通过DNA的复制合成进行测序，而非传统的链终止化学过程确定；同时，在空间上DNA以大规模平行的方式同时测定。但是在具体的测定原理上有焦磷酸测序、可逆终止子测序、连接酶介导测序、磷酸连接的荧光核苷酸测序等方法。本文使用的为Illumina MiSeq，采用的为可逆终止子进行测序，下文以此为例对其原理进行介绍。
该方法在包括核苷酸结合、荧光成像和裂解切割的循环中使用可逆的终止子结合dNTP（碱基ATCG的缩写）。即可逆终止子与特定的dNTP结合，当dNTP结合上DNA链，终止子通过终止或抑制基因修饰使得DNA合成在添加单碱基后终止，之后通过终止子结合荧光基团使得添加的单碱基序列，荧光成像后可逆终止子裂解脱落与未结合dNTP结合形成循环（图8）

（3）宏基因组测序

宏基因组测序是微生物研究领域新兴的研究思路，其不包含对某个特定微生物种群的靶向，而是对有所微生物基因组总和进行测定。本文测定微生物功能基因时使用的鸟枪法测序（Shotgun sequencing）即为微生物宏基因组测定的经典方法。其原理在于将基因组打断为数百万个DNA片段，对每一个片段进行测序后通过特定的计算机程序将所有零碎的DNA片段信息整合为整段的DNA序列

2．针对微生物测序的数据分析过程

拿到基因组测序的数据（如16S扩增子测序数据）后我们往往很迷茫，不明白数据如何处理和分析，下文将简单叙述宏基因组数据处理的一般步骤和常用参数。
（1）OTU的构建：OTU为系统发生学、群落遗传学研究中为了方便统计，在一定相似度下给某一分类单元设置的标志，通常按照97%的阈值（相似度）进行区分，相似度小于97%，则可以认为不同种，相似度小于93%-95%则可以认为不同属。OTU的构建是数据分析的基础，通常通过聚类分析给出。
（2）测序深度Coverage：一般在OTU的构建过程中计算机便会给出，是指样品基因文库的覆盖率，数值越高，表示测序样品中序列被测出的概率越高
（3）α多样性的分析（样品内的差异）

• 菌群丰度的计算——Chao1：是用chao1 算法计算群落中只检测到1次和2次的OTU数估计群落中实际存在的物种数。Chao1 在生态学中常用来估计物种总数，Chao1值越大代表物种总数越多
• 菌群多样性的计算——香农多样性：反应生物α多样性的大小，Shannon值越大，说明群落多样性越高。
  （4）β多样性的分析（样品间的差异）
• PCoA分析、PCA分析（主成分分析）：通过对数据的降维，寻找与数据差异最大因素，在横纵坐标上图进行体现
  
• NMDS分析（非度量多维尺度分析）：基于进化关系的样品组之间差异的比较，其通过排序在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本，从而使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息，但是与PCA等方法比摒弃了原始的数据大小，只保留数据顺序信息。