写在最前面
最近考试超多的好嘛，卷起来了，但又没完全卷。今天看了篇分子生物学的文章，觉得还挺有趣的，按自己的思路便写写看。文章为2020年的nature plants，题为Transfer cells mediate nitrate uptake to control root nodule symbiosis（具体见参考文献文献）
摘要
根瘤共生为植物提供了固氮的能力，从而提高作物产量。环境硝酸盐水平影响着根系结瘤和固氮，但是豆科植物调节硝酸盐吸收以调节根瘤共生的机制仍不清楚。通过鉴定苜蓿NPF家族的一个成员NPF7.6，观察到NPF7.6在根瘤维管组织中特异性表达，且定位于根瘤转移细胞的质膜上，在那里NPF7.6起到高亲和硝酸盐转运体的作用。进一步通过构建NPF7.6的突变体，使得突变体在根瘤维管组织发育异常，且表现出硝酸盐吸收减少、一氧化氮稳态紊乱和固氮酶活性减弱，基于此提出了NPF7.6参与根瘤调控的机制。(Wang et al., 2020)
一、传递细胞
传递细胞是一类特殊的薄壁细胞，在植物中一般位于维管组织内（图1a），起到转运营养物质的作用；其具有内折的质膜，形成许多指状不规则凸起以增大表面积（图1b），根瘤内的传递细胞也被称为NTCs
二、NPF7.6亚细胞定位和编码蛋白功能揭示
1．组织定位
（1）GUS染色
GUS 染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性，进行化学定位的一种方法。GUS（β-glucuronidase）是一种报告基因，其来源于大肠杆菌，编码β-葡聚糖苷酶，这种酶可以催化底物 5-溴-4-氯-3 吲哚葡聚糖醛酸苷（X-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，以观察特定基因的表达。通过在我们所研究基因的启动子（promoter）后接上 GUS 基因，当我们所研究的基因表达，其启动子被激活，GUS 基因也会随之表达，将植株通过 X-Gluc 进行染色后可显现深兰色，以此来显示特定基因的表达位置（图2）。
通过克隆NPF7.6的启动子并接上GUS基因构建pNPF7.6::GUS构建体，通过X-Gluc染色后可以观察到NPF7.6基因在根瘤维管组织内特异性表达（图3），植物基因的功能往往与基因的表达位置具有密切的关系，因此，这暗示我们NPF
7.6很可能与硝酸盐的运输有关。
（2）GFP亚细胞定位
GFP与GUS基因类似，都为报告基因，通过在苜蓿根的NPF7.6启动子后加入GFP基因，构建NPF7.6启动子驱动的NPF7.6::GFP构建体，GFP基因表达的蛋白可以显示出绿色荧光来显示基因的表达位置。
与GFP处理的对照组相比，BPF7.6::GFP的荧光定位于质膜（图4a），特别是在传递细胞向内凸起的细胞膜处（图4b），带有更亮的斑点，这表明NPF7.6定位于质膜部位，特别是细胞膜向内凸出的部位。通过三维重建荧光定位位置进一步揭示NTCs向内凸起细胞膜上的NFP7.6空间分布模式（图4c-d），我们可以观察到，NPF7.6很可能在根瘤共生期间在根瘤传递细胞上吸收硝酸盐，特别是传递细胞向内凸起的质膜上。
（3）编码蛋白功能验证
为了验证NPF7.6编码蛋白的作用，这里通过在卵母细胞中注射NPF7.6的cRNA进行评估，同时选取了高亲和的CHL1进行对比。在0.2和10mM的硝酸盐浓度下，NPF7.6的转运能力均低于CHL1，但是与对照组进行比较，NPF7.6表现出显著的硝酸盐转运能力（图5a）。进一步对NPF7.6进行动力学分析表明，对于硝酸盐的吸收，NPF7.6表现出具有饱和点的饱和动力学方式。因此，我们可以确定，NPF7.6编码高亲和的质膜定位的硝酸盐转运体。
与此同时，我们发现了NPF7.6的活性可以通过植物根瘤的定殖以及外界硝酸盐的浓度变化（图5c），这暗示我们NPF7.6很可能参与根瘤对于外界硝酸盐浓度的感应并调控根瘤的生长发育。
三、NPF7.6基因功能确认
1．NPF7.6突变体的构建
为了获得NPF7.6在根瘤共生中的作用，我们使用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除NPF7.6得到两个突变体（npf7.6-1、npf7.6-2），他们在NPF7.6基因第一个的第一个外显子区域存在突变。
2．NPF7.6突变体表型性状差异
将得到的NPF7.6突变体与野生型（R108）在不同硝酸盐浓度下培养以观察野生型与突变体对于外界硝酸盐的浓度。在表型上，NPF7.6突变体在高氮条件下表现为根结较短，而在低氮条件下表现为更大的根结，且保留高氮条件下的粉色表型（图7a）。进一步对根瘤的鲜重、根瘤长度和根瘤数目进行测定，数据表明NPF7.6的突变体与野生型相比在鲜重和根瘤长度方面变化的范围缩小（图7b-d），这表明NPF7.6的缺失导致了植物根系对于外界硝酸盐浓度的反应迟缓
进一步，我们根瘤进行横切以观察突变体在维管组织发育上的不同。对根瘤切片的扫描电镜显示，NPF7.6突变体的根瘤维管组织与对照组相比更为分散而显示为一种异常的维管组织发育模式（图8A-B）。我们已经指出了NPF7.6定位于传递细胞质膜，传递细胞最为特殊的为向内凸起的质膜，因此我们通过扫描电镜观察了突变体的传递细胞内突部位，并通过3D重建野生型和突变体的传递细胞内突结构。对照组R108中的传递细胞具有复杂结构的质膜内突，并伴有线粒体和广泛的内质网；与野生型光滑的内突相比，突变体内突表面呈现出夸张的锯齿状（图8C-D）。
这些证据表明，定位于传递细胞质膜的NPF7.6很可能通过调控硝酸盐的吸收来调控根瘤维管组织的表型可塑性。
四、NPF7.6调控机制的揭示
为揭示NPF7.6在根瘤共生中的调节机制，我们先对根瘤硝酸盐吸收进行探索。我们通过向根瘤表面添加N15标记的硝酸盐来模拟根瘤吸收外界硝酸盐的过程；同时向距根瘤2cm的根部区域添加N15标记的硝酸盐模拟根瘤从根系中吸收硝酸盐的过程，在添加硝酸盐2h后收集并测定根瘤中的N15含量。结果显示，缺失NPF7.6功能的突变体缺失了从根系中吸收硝酸盐的能力，同时从外界环境吸收硝酸盐的能力也有显著降低（图9a-b）。这些证据同时也证明了根瘤从外界和宿主根部吸收和运输硝酸盐需要NPF7.6。
基于NPF7.6对于根系吸收硝酸盐的功能，我们提出以下可能的机制：在无氮条件下，根瘤诱导NPF7.6的表达，使得根瘤可以从宿主根系中吸收硝酸盐以维持自身生长；低氮条件下，NPF7.6被大量表达，促进根系对于外界硝酸盐的吸收以缓解根瘤与宿主根系对于硝酸盐的竞争；而在高氮条件下，过量表达的NPF7.6使得胞内硝酸盐浓度升高而抑制了根瘤的生长（图9c）
NPF7.6在高氮条件下对于根瘤生长的抑制机理并未清楚，我们尝试从转录组方面选择可能的机理。通过转录组的分析我们发现了一类Lb蛋白的表达变化，这类蛋白是根瘤中最为丰富的蛋白质，具有维持NO稳态，保持硝酸盐活性的作用，以此为线索，我们发现了参与编码Lbs的11个基因中发生了9个基因的显著下调（图10a）；为了进一步确定Lbs的下调是否导致了NO的变化，我们通过DAF-2-DA方法进行了NO的染色，实验表明NO在突变体中表现为广泛的累积（图10b），NO荧光强度显著提高（图10c）。而NO的积累会显著降低固氮酶的活性，从而抑制了根瘤的生长。另外，胞外实验已经表明，高浓度的硝酸盐具有显著抑制Lb基因表达的作用
基于以上的证据，我们提出如下的高氮调控机制：在高氮条件下，过量表达的NPF7.6导致对于硝酸盐的过量吸收，从而导致胞内硝酸盐浓度的大量累积。高浓度的硝酸盐抑制了Lbs基因的表达，间接导致了NO的积累，从而抑制固氮酶的活性，根瘤的生长因此受到抑制（图11）
五、讨论
在拟南芥中，鉴定出两个硝酸盐转运家族NRT1、NRT2，前者更名为NPF家族。NPF家族的功能已经过大量的研究，在如uniprot在线平台可以检索其家族蛋白质的功能。对于NPF家族的功能研究，主要有以下方面：NPF在结节形成、结节器官发生中起核心作用；是表皮细胞中诱导皮层细胞分裂导致结节原基形成所必需的(Rival et al., 2012)；NPF参与结瘤前识别根瘤菌的第一步(Amor B.B., 2003)；NPF在根瘤与苜蓿根瘤菌共生期间需要通过触发感染线并将细菌释放到发育中的根瘤感染区的细胞质中(Moling et al., 2014)。
在拟南芥、水稻、玉米等作物中发现了大量的NPF家族基因，它们在硝酸盐吸收上都发挥着类似功能，这也为我们提供了研究基因功能的思路，先寻找同源基因的功能并基于此猜测和验证基因功能。
六、参考文献
Amor B.B., S. S. L., Oldroyd G.E.D., Maillet F., Penmetsa R.V., Cook D., Long S.R., Denarie J., Gough C. (2003). The NFP locus of Medicago truncatula controls an early step of Nod factor signal transduction upstream of a rapid calcium flux and root hair deformation. the plant journal, 34(4), 495-506.
Moling, S., Pietraszewska-Bogiel, A., Postma, M., Fedorova, E., Hink, M. A., Limpens, E., . . . Bisseling, T. (2014). Nod factor receptors form heteromeric complexes and are essential for intracellular infection in medicago nodules. Plant Cell, 26(10), 4188-4199. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25351493. doi:10.1105/tpc.114.129502
Rival, P., de Billy, F., Bono, J. J., Gough, C., Rosenberg, C., & Bensmihen, S. (2012). Epidermal and cortical roles of NFP and DMI3 in coordinating early steps of nodulation in Medicago truncatula. Development, 139(18), 3383-3391. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22874912. doi:10.1242/dev.081620
Wang, Q., Huang, Y., Ren, Z., Zhang, X., Ren, J., Su, J., . . . Kong, Z. (2020). Transfer cells mediate nitrate uptake to control root nodule symbiosis. Nat Plants, 6(7), 800-808. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32514144. doi:10.1038/s41477-020-0683-6