写在前面
作为一位热心市民，今天去帮对门好兄弟做了个提取培养细胞RNA的实验。虽然对于大部分同学来说，这个实验很简单来着，但是我得写一写以免一天摸鱼无所事事（狗头）。
实验设计
对门好兄弟的实验是观察到根系一类菌在某一节点具有两种代谢途径，便打算通过测定两种代谢途径下游的RNA的表达，来从经济角度考虑其生存策略。在处理后在不同时间段采样以分析RNA表达随处理时间的变化，其包含近30个测定指标（RNA），通过qPCR对表达量进行定量。
RNA提取试剂盒
使用的试剂盒为TIANGEN的RNA提取试剂盒，主要成分如下：
- 裂解液RL（Buffer RL）：主要功能为裂解细胞
- 去蛋白液RW1（Buffer RW1）：主要功能为洗去蛋白质
- 漂洗液RW（Buffer RW）：用于漂洗（这不是没说？）
- 无RNA酶双蒸水（RNase-Free ddH2O）
- RNase-Free吸附柱CR3（RNase-Free Columns CRS set）
- RNase-Free过滤柱（RNase-Free Columns Cs set）
- RNase-Free DNase I：DNA 的消化液
- RDD缓冲液：DNA消化缓冲液
- RNase-Free离心管
所有试剂盒提取RNA 的原理大同小异，都是通过裂解液裂解细胞后通过过滤柱，在乙醇下DNA、RNA固定与吸附柱，再进行漂洗、去掉蛋白等过程；之后加入DNase去掉DNA得到RNA。
注意事项
最重要的就是预防RNase的感染，不然哦，白忙活哦！
- 建议带个口罩操作哈
- 多换手套
- 别省那点枪头哈
- 使用RNase-Free的水，别乱加就行
实验步骤
- 取出细菌样品，在室温下融化
- 在细菌中提前加入β-巯基乙醇；
- 轻弹离心管底部（经验步骤），加入350ul RL Buffer（一般细菌量不多就加这么多）
- 旋震荡10s，室温培养10min，其中每2min旋涡10s
- 所有溶液转运至过滤柱CS上，12000rpm下离心2min
- 向滤液加入350ul（经验数值） 70%乙醇，混匀后转移入吸附柱CR3，12000rpm下离心2min后倒掉滤液
- 向吸附柱加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min后倒掉滤液
- 配置DNase工作液，DNase I与RDD缓冲液体积比为1:7；根据要进行的个数配置工作液（一般可以配置所需溶液的1.2倍）
- 向吸附柱中央（尽量滴到中央哦）加入80ul DNase工作液，室温放置15min
- 向吸附柱中加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min，弃去滤液
- 向吸附柱加入500ul漂洗液RW（RW实现加入酒精）后室温静置2min，12000rpm下离心2min后弃去滤液。这个过程重复2次
- 12000rpm下再离心2min后弃去滤液，打开离心管盖室温放置数分钟以除去残余漂洗液以免对RT等测定产生影响
- 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管，加入60ul（选择范围30-100ul，推荐分两次加入）RNase-Free ddH2O后室温放置2min，12000rpm下离心2min，滤液即为RNA
- 如果要对RNA保存，请于-70℃环境保存
哦，这该死的好奇心
