喜闻乐见碎碎念
今天又帮对门兄弟提了一天RNA，我一不看着他就做错好几步，分明是来帮实验的倒是变成教实验的。不禁感慨，和你做实验像坐牢（笑死）
这个兄弟后续会测定RNA浓度、qPCR，趁着在实验室“坐牢”，就问了问怎么设计引物，抱着该死的好奇心，我花了一晚上整明白了（芜湖）
引物设计要求
- 长度15-30bp
- CG含量40-60%
- 引物模板序列Tm 72℃最佳，至少55-80℃
- 3'端引物一般不使用A
- 避免3'端出现3个碱基重复
- 等等
引物设计软件
Primer Premier 6
请自行下载（去微信搜搜或许是个好方法）
分析步骤
1.下载基因序列数据
通过NCBI下载基因数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
在搜索框输入对应基因名称检索基因序列数据，这里我们使用Arabidopsis thaliana NRT1.1 基因，其为拟南芥中硝酸盐转运蛋白基因，下载序列。
通过Primer Premier设计引物
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打开Primer Premier 6 软件
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在file-open-sequence打开下载的基因序列，打开效果如上图
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选择 analyze-primer search
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在弹出的设置页选择primer parameters对参数进行设置
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1.其中Tm为熔融温度
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2.Ta 为退火温度（应该）
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3.amplicon lenght 为产物长度
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4.alternate primer pairs为可替换碱基对
其中最重要的为熔融温度 -
点击serch返回检索得到的引物序列，默认显示best 的引物序列
其中会显示引物的rating和引物的具体信息，包括引物序列、位置、长度、Tm值等信息。在右上的序列图上会显示扩增序列序列位置 -
右击引物序列选择all primers返回可选择的引物序列列表及其信息，点击all structure可以显示其结构，根据需要选择合适的引物序列点击replace选择替换
引物序列验证
选择的引物序列需要进行验证
- 在NCBI主页上选择blast后选择primer-blast
- 在use my own foraward primer框后输入先引物序列，其序列可以右键引物后选择copy sense primer复制
- use my own reverse primer框输入后引物序列，其可以右键copy anti-sense primer复制
- 在organism输入需要扩增的物种名称
- 点击get blast获取报告
-读取报告
primer-blast选择只有一个基因NRT1.1与引物序列匹配，特异性挺好，就他了。
完毕
接下来把序列交给公司就搞定了
芜湖，好奇心满足了
