发布于 由wu, bin

基于GUS报告NtNRT1.2启动子的活性鉴定

一、实验材料

  • NtNRT1.2 Promoter::GUS的转基因烟草（根系）。实验使用的预测性启动子为NtNRT1.2基因编码的起始密码子上游2000bpDNA片段。

    二、原理

    GUS染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性，并进行化学定位的一种方法。GUS（β-glucuronidase）是一种报告基因，其来源于大肠杆菌，编码β-葡聚糖苷酶，这种酶可以催化底物5-溴-4-氯-3吲哚葡聚糖醛酸苷（X-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，以观察特定基因的表达。
    通过在我们所研究基因的启动子后接上GUS基因，当我们所研究的基因表达，GUS基因也会随着表达，将植株通过X-Gluc进行染色后可显现深兰色，以此来显示特定基因的表达位置（图1）
    图1：Repoter Gene 的作用机理

    三、实验步骤

    1．种子的消毒灭菌

    1. 将种子置于1.5mL离心管，加入70%乙醇表面消毒1-2分钟
    2. 移去酒精，加入Bleach溶液（2%次氯酸钠+0.1%SDS），吹打几下后，浸泡15-20分钟
    3. 在超净台中移去Bleach，使用无菌水清洗5遍以上，清洗时移液枪头插至离心管底，缓慢吸取液体
    4. 清洗后的种子放置于培养皿内灭菌的滤纸上，晾干备用

2. 幼苗的平板培养

  1. 将置于滤纸上的拟南芥种子经过表面喷洒酒精消毒置于超净台中
  2. 双手进入超净台进行操作前佩戴橡胶手套，同时对双手、手臂以及所以放入超净台的物品（培养基、移液枪等）进行酒精喷洒消毒
  3. 待双手及所有物品上酒精蒸发后，点燃酒精灯，打开培养基，将镊子置于酒精灯火焰上灼烧至略红
  4. 将镊子拿离火焰，稍稍冷却后夹取牙签，用手拿取镊子夹住的一头
  5. 用牙签先微微沾取少量培养基，将滤纸上种子沾至牙签，点至培养基
  6. 点约20-25个种子，每个种子距约1cm
  7. 点种完毕后上覆盖子，用封口膜密封
  8. 4℃冰箱进行处理1-2天后于拟南芥培养室培养培养（21-22℃、光照16h/黑暗8h、关照强度80-120 微mol/(m-2s-1)），竖直放置待种子生长8-10天

注意事项

  • 1.种子消毒时候应当进行吹打，使得消毒充分
  • 2.吸取与液体时应当移液管枪头插入离心管底部，再缓慢吸取液体
  • 3.所有物品包括双手、手臂进入超净台之前务必使用酒精消毒，避免污染
  • 4.在超净台内点燃酒精灯前要确认超净台所有物品及双手上无肉眼可见酒精
  • 5.超净台内镊子竖直放置
  • 6.牙签拿取部位应该是镊子的夹取部位以保证另一端的无菌
    MS培养基配方

3．GUS组织化学染色及显微镜观察

  1. 配置GUS染色液（共1mL）
  2. 将待处理的幼苗从培养基上取下放入染色液
  3. 于37℃培养箱黑暗处理12h以上
  4. 将染色好的幼苗置于70%酒精中脱色后于显微镜下观察
    GUS染色液配方

结果

1.拟南芥平板观察

其实最开始进行染色的是拟南芥，后来拟南芥染不上色，就用了染好的烟草来观察。
经过平板培养的拟南芥已生长出叶和较长的根，由于培养时候整个培养基竖直摆放，拟南芥根在培养基表匍匐生长，便于取出

图1.平板培养拟南芥图片

2．染色烟草显微镜下观察

在肉眼下观察染色烟草根系，发现染色区域多集中于整根，侧根区域染色较少，且成熟的上部根系染色较为明显，而较为幼嫩的下部根系染色程度较低，甚至不染色（图2a），因此我们猜测，NtNRT1.2多在根系成熟成熟区域表达，由于根系成熟区域主要执行养分吸收功能，因此我们猜测NtNRT1.2应该与植物根系成熟区的氮吸收有关。
接下来我们将烟草根系置于低倍显微镜下进行观察，我们发现根系的中柱部分显示出大范围的染色，表面NtNRT1.2在中柱区域大量表达，而侧根原基区域并为显示出明显染色（图2b）；进一步在高倍镜下观察侧根，发现侧根没有显示出明显染色。
图2.染色烟草显微镜观察：a：肉眼观察烟草根系；b：低倍显微镜观察烟草根系（示侧根原基）；c：高倍镜下观察烟草根系（示中柱和顶端分生组织）
在观察的同时，我们发现在侧根的根尖出现了略微染色（图3a），观察其他烟草根系，并未发现侧根根尖染色的情况，在此植株的其他侧根上也较少发现类似现象，这一小概率现象还待进一步考证。同时我们观察到一个有趣的现象，在侧根与主根中柱的汇集处，染色程度较深，这可能是由于中柱较为集中导致的（图3b），但是我们也大胆的猜测，中柱的汇集处可能存在分配养分运输的机制，因此需要更多转运蛋白协调物质的中柱养分分配，因此与氮素营养运输有关的NtNRT1.2表达量增加
图3：a.根尖染色的侧根；b.主根与侧根中柱汇集区域的染色状况
综上所述，烟草根系染色在主根区域较为明显，且较为成熟的区域颜色程度较高，染色的具体区域为中柱，因此，我们猜测NtNRT1.2定位于植物根系成熟区域的中柱，参与植物根系的氮的长距离运输。

讨论

正经人谁猜啊，我直接打开UniProt直接搜索NtNRT1.2蛋白，还真搜到了。

提交名称NRT1.2，由烟草（Common tobacco）NtNRT1.2-s基因表达，定位于膜，参与硝酸盐的跨膜运输，铵态氮的系吸收。也有证据表明其可能参与磷酸根离子和寡肽的运输。
进一步，我们又发现一篇刊于《frontiers in Plant Science》2018; 9: 210的文献，看了看这篇文献的作者，我一瞬间明白了我们可爱的刘老师为啥让我们做NtNRT1.2的GUS染色(Liu et al., 2018)。
通过不同的氮处理下，间隔一段时间测定烟草根系和叶片中的NtNRT1.2的表达，可以发现NtNRT1.2对于氮具有一定的反应，特别是硝态氮，随着硝态氮的输入，NtNRT1.2在一段时间后显著表达，且这种表达会受到氮缺乏的抑制（图4），因此不难猜测NtNRT1.2应当参与了植物根系硝酸盐反应
图4.NtNRT1/2不同氮处理的响应：紫色为根系，蓝色为叶片(Liu et al., 2018)
对植物根系一天内不同时间段内的NtNRT1/2的基因表达的测定表明NtNTR1.2在6:00与8:00达到表达高峰（图5），考虑到植物在夜间需要进行活跃的碳水化合物同化，此过程需要大量的氮素提供，因此这暗示我们NtNRT1.2应当与氮的吸收和运输相关
图5.一天内不同时间根系的NtNRT1/2基因表达(Liu et al., 2018)
更进一步，通过在拟南芥nrt1.1-1突变体内转入NtNRT1.1与NtNRT1.2 的基因来验证其基因功能。半定量RT-PCR证明了NtNRT1.1/1.2在拟南芥中的表达，通过拟南芥叶片和根系鲜重的测定（图6），证明了NtNRT1.1/1.2显著提高突变体生长状况，间接证明了NtNRT1.2参与植物根系硝酸盐的吸收。
图6.拟南芥突变体内表达NtNRT1.1/1.2可显著改善其在硝酸盐上的生长状况(Liu et al., 2018)

参考文献

Liu, L. H., Fan, T. F., Shi, D. X., Li, C. J., He, M. J., Chen, Y. Y., . . . Sun, Y. C. (2018). Coding-Sequence Identification and Transcriptional Profiling of Nine AMTs and Four NRTs From Tobacco Revealed Their Differential Regulation by Developmental Stages, Nitrogen Nutrition, and Photoperiod. Front Plant Sci, 9, 210. doi:10.3389/fpls.2018.00210