不同玉米品种根际水解酶的原位研究
写在最前面
这个科研项目是我大二时的urp项目，得到了导师和郝师兄的许多帮助（感谢师兄该我的学术垃圾），基于作者只是一个快乐科研的本科生，如有错误，请您友好地指正。
一、研究目的
根际（rhizosphere）指受根系活动影响的土壤区域，是重要的土壤微生物活性热区，由根系释放释放根系分泌物和其他根际沉积物形成 (Kuzyakov & Blagodatskaya, 2015)。这些根际沉积物可以激活微生物，增加胞外酶合成分泌，导致根际区域的生物化学进程十分剧烈。根际范围可以影响的范围从根表延申到土体土壤，取决于不同土壤养分状况、根系形态结构和根系分泌物的质量和数量酶活性根际热区可以延申到1-3mm (Kuzyakov & Razavi, 2019; Ma et al., 2018; Tian, Razavi, Zhang, Wang, & Blagodatskaya, 2020)。根际区域是植物与土壤交换能量和养分的关键区域，且可以通过调节生物化学反应的强度和范围，以应对外界环境变化。土壤酶是土壤生物化学进程的关键，因此关于植物根际区域酶活性和热区范围的研究具有十分重要意义。
传统的荧光微孔板酶活性检测方法只能通过检测单点的酶活性，而无法真实反应原位土壤酶活性，难以精确区分根际酶活性和非根际酶活性。且该方法在检测过程中，需将土壤制成土壤匀浆，所检测的酶活性包含前期微生物（作物根系）分泌的残留酶，这部分酶被土壤掩蔽，在自然条件下不会显示活性，因而无法区分所测的酶活性是由微生物（植物）对底物添加的响应还是固定在土壤中微生物前期分泌的残留酶活性(Nannipieri et al., 2012)
新兴的酶谱技术可以实现酶活性原位二维显示(Razavi, Zarebanadkouki, Blagodatskaya, & Kuzyakov, 2016)，该方法可以测定酶活性在根际的原位分布，已有研究表明不同的根系构型、不同品种、有机肥添加、养分差异和重金属污染以及不同酶之间的根际酶活性热区范围存在显著差异(Ge et al., 2017; Liu et al., 2017; Ma et al., 2019; Wei et al., 2018)
玉米是我国的重要作物，在粮食、能源等方面具有重要的作用，氮肥的投入是玉米持续高产的主要原因(Guo et al., 2010)。随着工业氮肥合成技术推广以来，化学氮肥投入已达到一百年前氮输入的10倍(Canfield, Glazer, & Falkowski, 2010)。过量的N肥投入不仅会导致N肥利用率降低，还会造成环境问题。因此通过育种培育氮高效玉米品种，提高氮肥利用效率对玉米高产稳产，环境保护至关重要。我国在玉米育种方面具有长达数十年的经验，培育出了许多高产高效的玉米品种，而关于高效玉米品种根系如何挖掘土壤养分的是我们所不知的，此研究选取两种玉米品种（郑单958、先玉335），通过酶谱法测定比较两种品种玉米的根际水解酶分布状况。此研究是根际氮高效玉米养分高效吸收的根际-土壤-微生物互作体系研究的一部分，以揭示氮高效玉米根际酶分布如何支持玉米养分利用的高效性，并进一步为根际-土壤-微生物体系的研究提供支持。
二、材料和方法
1.试验设计
选取郑单958与先玉335两个品种，其都为常见的氮高效玉米品种。土壤使用来自农民传统施肥方式的土壤，将土壤过2mm筛后混匀，分为两组，一组不做处理，一组加入氮肥，可以认为本实验存在高氮土壤和不施氮的低氮土壤两个水平。实验共设置两因子、两水平共4个处理，其中每个处理设置3个重复。（图1）
2.播种管理
选取24cm*30cm的根盒，有机玻璃板上附聚酰胺膜，加入事先处理的土壤至根盒重1.2kg，玉米种子经过双氧水消毒后，放置于饱和硫酸钙中浸泡6h后置于湿润滤纸上一个晚上。种植前浇水湿润土壤，将种子放入土壤1cm深，再放入人工气候室中倾斜45°（使得根系与聚酰胺膜玻璃面接触）进行培养。土壤换水率为田间持水量的60%，培养期间通过称重法补水。（图1）
3.酶谱测定
酶谱测定选取与碳代谢有关的酶为纤维素酶（BG）；与氮代谢有关酶为α-N-乙酰氨基葡糖苷酶（NAG）；与磷代谢有关酶为磷酸酶（AP），其对应底物见表1。培养至20天后进行酶谱分析，拍摄根际酶谱图后根据酶谱图取出根际土与非根际土进行酶活性测定。
| 类别 | 酶 | 底物 |
|---|---|---|
| 与碳代谢有关 | 纤维素酶（BG） | 4-MUF-β-D-xylopyranoside |
| 与氮代谢有关 | α-N-乙酰氨基葡糖苷酶（NAG） | 4-MUF-β-D-glucopyranoside |
| 与磷代谢有关 | 磷酸酶（AP） | 4-MUF-β-D-Phosphate |
| 与氨基酸代谢有关 | 亮氨酸氨基肽酶（LAP） | L-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin |
表1：酶谱分析各种酶对应底物(German et al., 2011)
三、实验结果
1.根盒玻璃板肉眼观察
二十天后观察根盒玻璃板面，观察可见两组施肥处理根系密度远大于未施肥处理，且先玉335（XY335）品种根系密度大于郑单958（ZD958）品种（图2 ）
2.根际酶谱图像
对聚酰胺膜进行拍摄得到的图片（图3），可见施氮处理增加了根际水解酶的活性和范围。且先玉品种较郑丹品种具有更好的根际酶活性与范围，先玉品种更加适应低氮胁迫。
图3是师兄的图，就不放了hhhh
3.酶谱图像灰度值、热区半径分组分析
通过图像处理软件image J (V6.2.4)将像素转化为256位的灰度模式（其中红色灰度为255，对应最高酶活性；蓝色灰度为0，对应最低酶活性），在此基础上减去聚酰胺膜的背景灰度值得到酶谱图数据。观察根际的灰度值在112以上分布，这里人为选取112、128、160作为阈值，通过将各组酶谱图的灰度值将酶活性范围分为酶活性热区（160-255）、中等热区（128-160）、低热区（112-128）三组，得出对应的各组平均灰度与范围半径。
关于NAG酶，所选的三个阈值范围内，处理表现为类似的趋势，均表现为先玉低氮灰度值最高，郑单高氮灰度值最低，且呈现出显著差异。在低氮和高氮条件下，尽管未表现出显著性，可以观察到先玉品种的平均灰度值均高于郑单品种（图4B）。根际热区范围方面，在不同的灰度值阈值区域，高氮条件下的根际热区范围均高于低氮条件，说明低氮条件下的根系活动拓宽了酶活性的范围。另一方面，在低氮条件下，可以观察到郑单品种在给定阈值范围内的热区范围显著大于先玉品种，说明在低氮条件下，郑单品种具有更大的热区范围（图4A）。通过分析可得，郑单与先玉品种在低氮条件下都会通过根系活动增加NAG酶的活性和范围，但同时两个品种的侧重点有所不同，具体表现在先玉品种在酶活性方面更有优势；而郑丹品种更侧重于酶活范围。
LAP酶在所选择的三个阈值范围内，并未呈现出明显显著性差异。在热区半径方面，112-128、128-160的灰度阈值区域呈现出相似趋势，即低氮条件下郑丹品种LAP热区半径较小；而高氮条件下先玉品种LAP酶热区半径较大（图5A）。在灰度值128以上的区域内，高氮与低氮条件下，先玉品种都呈现出更大的热区范围，说明先玉品种可能具备比郑单品种更大的根际区域（图5B）。
在所选择的三个灰度阈值范围内，各处理并未表现出显著性差异，但不同处理呈现出相似趋势，即高氮条件下郑丹根际BG酶活性高于先玉，而在低氮条件下则低于先玉（图6B）。在热区范围方面，高氮条件下，郑单表现出更大的根际热区范围，而在低氮条件下并未表现出显著性（图6A）。
三、讨论
酶是参与土壤有机质降解和土壤养分循环的关键(R. L. Sinsabaugh et al., 2008)，随着农业绿色可持续发展观念的兴起，土壤酶指标逐渐被纳入土壤健康的评价指标之一(Cao, Sun, Yang, Sun, & Zhao, 2003)。
此研究中我们发现了玉米品种在根际热区范围与酶活性方面的差异，面对低氮胁迫，先玉335通过增加酶活性，而郑丹通过增加酶热区范围。这种差异体现了玉米品种面对养分胁迫的不同选择策略。增加酶活性可以提高对土壤有机质的矿化程度，增加活性养分供应，而酶活性热区范围的增加，可以在保证确定根系大小的情况下增加养分吸收区域。以往的研究重点主要是酶活性高低，对酶活性热区范围的研究不够。
植物如何通过调节根际酶活性与范围间的平衡是我们所不知的。在一项水稻的根际酶谱研究中便引入了生态学的r对策与k对策的概念加以解释(Wei et al., 2018)，快速发展的r对策微生物偏爱于利用简单底物，而k对策微生物更适宜于难降解的底物（如纤维素、木质素）。植物根系具有分泌碳源的能力，刺激根系周围r对策微生物的生长，加速对酶的合成(Spohn & Kuzyakov, 2013)，土壤根源碳的含量会随着与根表的距离增加而迅速降低，导致k对策微生物的数量增加，有研究报道在土壤与根系距离增加的情况下，发现了k对策微生物（放线菌）的数量增加(Kawasaki A, 2016)，这说明植物可能是通过根系碳源的释放，对根际微生物群落进行调整，进而改变了酶活性与酶活性范围。
酶谱法是近几年新兴的原位酶活性表征技术，分析的结果会受到许多因素的影响，其中底物向土壤的扩散以及成像步骤常常会影响实验结果的准确性。
在背景校正方面，因为聚酰胺膜上其他物质对于光的发射可能会影响酶谱图的拍摄，因此我们使用空白的聚酰胺膜进行背景校正，而事实上许多土壤中的许多有机化合物可以扩散入聚酰胺膜，在紫外光下呈现出荧光（如腐殖质和其他一些重金属元素(Nobuo Watanabe, 2004)），这是本实验所欠缺考虑的。
酶在根系的活性范围扩张受到两个关键过程的影响，分别是酶生产者（主要是微生物）的定殖和活性(Kuzyakov & Blagodatskaya, 2015)，以及酶和底物的扩散，其中后者受到碳和养分利用效率的调节(Robert L. Sinsabaugh et al., 2014; Zhu et al., 2018)，因此根系酶活性区域的大小在一定程度可能与植物养分利用效率密切相关。在此基础上，我们通过灰度值人为划定的热区范围能否在一定程度上表示根际酶活性区域是一个值得研究的命题。
五、小结
通过土壤酶谱技术使我们能够可视化地研究玉米根际酶活性及其分布，两种玉米品种均可以通过增加酶活性与酶热区范围来适应低氮条件，而两者在面对养分胁迫的不同选择策略存在差异，先玉品种侧重于增加酶活性，促进有机物矿化，而郑丹品种偏向于增加酶活区域来扩大植物养分吸收的范围。基于此实验结论，我们猜测先玉与郑丹品种根际酶活性与范围的差异通过植物根系碳源的分泌加以调控。因此，对植物根际酶活性及其范围的进一步研究是必要的，以挖掘氮高效玉米品种的根际作用机理及其调控机制。
六、参考文献
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写在最后
本实验就存在许多问题和不严谨的地方，其中最最致命的是在灰度阈值范围的选取上，其实关于这方面的文献内容很少，这个阈值范围就是随意确认的。不过这是我大二时的科研训练项目，之后就对分子生物和基因组学感兴趣了，结题之后就没有继续修改了。
