写在前面

今天写一写聚类图的绘制，因为作者这是个对生信感兴趣的非生物学本科生；再加上我一直认为像我这种靠兴趣学习的小白，从分析过程入手进行学习会有趣些，所以这次内容可能会偏向于操作，具体的原理可以看看其他大佬的。

系统发生数数据的获取

系统发生数的构建主要是基于SNP进行，其具有距离矩阵法、最大似然法、最大简约法和贝叶斯法，其中距离矩阵法中的邻接法为一种常见的方法（各方法具体的原理可见其他大佬的推文，或者等我学完来写写）。
为了省时又便于理解，我们通过tassel5进行获取数据

• 将SNP数据导入tassel5软件
• analysis-relatedness-creat tree 进行构建系统发生树
• 在返回的文件上选择results-archaeopteryx tree可以康一康构建出来的树
  

但是，这图明显不好看啊，和我在文章里面看的完全不一样啊

系统发生树数据的导出

在analysis-relatedness-creat tree结果文件导出为newwick格式

系统发生树的美化

方式一：通过iTOL平台

网址如下：https://itol.embl.de/

自己玩泥巴去吧（自己摸索摸索，很简单来着）

方式二：通过R package-ggtree

ggtree 是Guangchuang Yu（人称Y叔）构建的系统发生树构建的R package，这是ggtree的主页https://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/ggtree/inst/doc/ggtree.html

1、安装package-ggtree

#the first way
install.packages("ggtree")
#一般情况下rstudio默认的源里面是找不到ggtree
#因此可以通过BiocManager下载
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("ggtree")

下载完成后library()一下看一下安装完成否

2、读取.new数据

library(stringr)
library(ggtree)
library(treeio)
tree<-read.tree("tree.nwk")
ggtree(tree,branch.length = 'none',layout = 'circular')+
  geom_tiplab(size=1)

可以看到ggtree的绘制格式类似于ggplot2

3、具体参数介绍

#颜色大小类型等设置类似于ggplot2
ggtree(tree, color="firebrick", size=2, linetype="dotted")
#发生树默认以阶梯状排列，可以自行控制
ggtree(tree, ladderize=FALSE)

系统发生树的类型可以自定义

ggtree(tree, layout="roundrect")
ggtree(tree, layout="slanted")
ggtree(tree, layout="ellipse")
ggtree(tree, layout="circular")
ggtree(tree, layout="fan", open.angle=120)
ggtree(tree, layout="equal_angle")
ggtree(tree, layout="daylight")
ggtree(tree, branch.length='none')
ggtree(tree, layout="ellipse", branch.length="none")
ggtree(tree, branch.length='none', layout='circular')
ggtree(tree, layout="daylight", branch.length = 'none')
#具体效果见下图，更多的效果可以通过设置坐标等进行更改

进化树的组件

#通过geom_treescale()控制
ggtree(tree)+geom_treescale()
#其中参数为
ggtree(tree) + geom_treescale(x=0, y=45, width=1, color='red')
ggtree(tree) + geom_treescale(fontsize=6, linesize=2, offset=1)
#xy控制数的比例位置
#width控制树宽度
#fontsize控制文本大小
#linesize控制线大小
#offset控制文本偏移量
#color控制文本颜色

#通过theme_tree2()添加树的X轴
ggtree(tree) + theme_tree2()

#通过geom_nodepoint()显示内部节点
#通过geom_tippoint()显示外部节点
ggtree(tree) + geom_point(aes(shape=isTip, color=isTip), size=3)

#geom_text()控制显示节点和提示标签
#geom_label()控制显示节点和提示标签
#geom_tiplab()控制显示提示标签
ggtree(tree, layout="circular") + geom_tiplab(aes(angle=angle), color='blue')
#见下图B

#geom_rootedge()控制显示根边
ggtree(tree1) + geom_tiplab() + geom_rootedge()
#通过aes(color=)控制颜色

系统发育树注释

#具体参数如下
Layer   Description
geom_balance    highlights the two direct descendant clades of an internal node
geom_cladelabel annotate a clade with bar and text label
geom_facet  plot associated data in specific panel (facet) and align the plot with the tree
geom_hilight    highlight selected clade with rectanglar or round shape
geom_inset  add insets (subplots) to tree nodes
geom_label2 modified version of geom_label, with subsetting supported
geom_nodepoint  annotate internal nodes with symbolic points
geom_point2 modified version of geom_point, with subsetting supported
geom_range  bar layer to present uncertainty of evolutionary inference
geom_rootpoint  annotate root node with symbolic point
geom_rootedge   add root edge to a tree
geom_segment2   modified version of geom_segment, with subsetting supported
geom_strip  annotate associated taxa with bar and (optional) text label
geom_taxalink   Linking related taxa
geom_text2  modified version of geom_text, with subsetting supported
geom_tiplab layer of tip labels
geom_tippoint   annotate external nodes with symbolic points
geom_tree   tree structure layer, with multiple layout supported
geom_treescale  tree branch scale legend

因内容过多，具体内容可见 Data Integration, Manipulation and Visualization of Phylogenetic Trees，反正我直接偷跑先开始学了~

喜闻乐见碎碎念

今天又帮对门兄弟提了一天RNA，我一不看着他就做错好几步，分明是来帮实验的倒是变成教实验的。不禁感慨，和你做实验像坐牢（笑死）
这个兄弟后续会测定RNA浓度、qPCR，趁着在实验室“坐牢”，就问了问怎么设计引物，抱着该死的好奇心，我花了一晚上整明白了（芜湖）

引物设计要求

搬运自其它博主

• 长度15-30bp
• CG含量40-60%
• 引物模板序列Tm 72℃最佳，至少55-80℃
• 3'端引物一般不使用A
• 避免3'端出现3个碱基重复
• 等等

引物设计软件

Primer Premier 6
请自行下载（去微信搜搜或许是个好方法）

分析步骤

1.下载基因序列数据

通过NCBI下载基因数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

在搜索框输入对应基因名称检索基因序列数据，这里我们使用Arabidopsis thaliana NRT1.1 基因，其为拟南芥中硝酸盐转运蛋白基因，下载序列。

通过Primer Premier设计引物

• 打开Primer Premier 6 软件
  

• 在file-open-sequence打开下载的基因序列，打开效果如上图

• 选择 analyze-primer search

• 在弹出的设置页选择primer parameters对参数进行设置
  

• 1.其中Tm为熔融温度

• 2.Ta 为退火温度（应该）

• 3.amplicon lenght 为产物长度

• 4.alternate primer pairs为可替换碱基对
  其中最重要的为熔融温度

• 点击serch返回检索得到的引物序列，默认显示best 的引物序列
  
  其中会显示引物的rating和引物的具体信息，包括引物序列、位置、长度、Tm值等信息。在右上的序列图上会显示扩增序列序列位置

• 右击引物序列选择all primers返回可选择的引物序列列表及其信息，点击all structure可以显示其结构，根据需要选择合适的引物序列点击replace选择替换

引物序列验证

选择的引物序列需要进行验证

• 在NCBI主页上选择blast后选择primer-blast
  
• 在use my own foraward primer框后输入先引物序列，其序列可以右键引物后选择copy sense primer复制
• use my own reverse primer框输入后引物序列，其可以右键copy anti-sense primer复制
• 在organism输入需要扩增的物种名称
• 点击get blast获取报告
  -读取报告
  
  primer-blast选择只有一个基因NRT1.1与引物序列匹配，特异性挺好，就他了。

完毕

接下来把序列交给公司就搞定了

芜湖，好奇心满足了

写在前面

作为一位热心市民，今天去帮对门好兄弟做了个提取培养细胞RNA的实验。虽然对于大部分同学来说，这个实验很简单来着，但是我得写一写以免一天摸鱼无所事事（狗头）。

实验设计

对门好兄弟的实验是观察到根系一类菌在某一节点具有两种代谢途径，便打算通过测定两种代谢途径下游的RNA的表达，来从经济角度考虑其生存策略。在处理后在不同时间段采样以分析RNA表达随处理时间的变化，其包含近30个测定指标（RNA），通过qPCR对表达量进行定量。

RNA提取试剂盒

使用的试剂盒为TIANGEN的RNA提取试剂盒，主要成分如下：

• 裂解液RL（Buffer RL）：主要功能为裂解细胞
• 去蛋白液RW1（Buffer RW1）：主要功能为洗去蛋白质
• 漂洗液RW（Buffer RW）：用于漂洗（这不是没说？）
• 无RNA酶双蒸水（RNase-Free ddH2O）
• RNase-Free吸附柱CR3（RNase-Free Columns CRS set）
• RNase-Free过滤柱（RNase-Free Columns Cs set）
• RNase-Free DNase I：DNA 的消化液
• RDD缓冲液：DNA消化缓冲液
• RNase-Free离心管

所有试剂盒提取RNA 的原理大同小异，都是通过裂解液裂解细胞后通过过滤柱，在乙醇下DNA、RNA固定与吸附柱，再进行漂洗、去掉蛋白等过程；之后加入DNase去掉DNA得到RNA。

注意事项

最重要的就是预防RNase的感染，不然哦，白忙活哦！

• 建议带个口罩操作哈
• 多换手套
• 别省那点枪头哈
• 使用RNase-Free的水，别乱加就行

实验步骤

• 取出细菌样品，在室温下融化
• 在细菌中提前加入β-巯基乙醇；
• 轻弹离心管底部（经验步骤），加入350ul RL Buffer（一般细菌量不多就加这么多）
• 旋震荡10s，室温培养10min，其中每2min旋涡10s
• 所有溶液转运至过滤柱CS上，12000rpm下离心2min
• 向滤液加入350ul（经验数值） 70%乙醇，混匀后转移入吸附柱CR3，12000rpm下离心2min后倒掉滤液
• 向吸附柱加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min后倒掉滤液
• 配置DNase工作液，DNase I与RDD缓冲液体积比为1:7；根据要进行的个数配置工作液（一般可以配置所需溶液的1.2倍）
• 向吸附柱中央（尽量滴到中央哦）加入80ul DNase工作液，室温放置15min
• 向吸附柱中加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min，弃去滤液
• 向吸附柱加入500ul漂洗液RW（RW实现加入酒精）后室温静置2min，12000rpm下离心2min后弃去滤液。这个过程重复2次
• 12000rpm下再离心2min后弃去滤液，打开离心管盖室温放置数分钟以除去残余漂洗液以免对RT等测定产生影响
• 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管，加入60ul（选择范围30-100ul，推荐分两次加入）RNase-Free ddH2O后室温放置2min，12000rpm下离心2min，滤液即为RNA
• 如果要对RNA保存，请于-70℃环境保存

哦，这该死的好奇心