通过Tassel进行GWAS分析

先康康tassel啥样

tassel5是由康奈尔实验室开发的生物分析软件，在谷歌搜索tassel5进行下载就完事了。
安装完毕，打开tassel界面

先介绍目录框

【file】

主要进行数据的读取，存储

open
open as
save as
等等

【data】

主要进行表格数据的处理
intersect join用的地方比较多

【impute】

以不同的方法进行填充数据

【filter】

进行质控
traits：筛选表型列
sites：对位点进行筛选
taxas：对个体进行筛选

【analysis】

分析，gwas操作的主要部分
diversity：在多自交系下较少用到，没什么意义
relatedness：包括PCA、构建亲缘矩阵、聚类分析等
association：gwas的主要部分，包括一般线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）等

导入数据

我们需要以下数据

1. 表型数据：通过file-open打开
1. 基因型数据
为plink数据格式，选取open as-plink，选择对应.ped与.map文件
其他数据格式：open as-选取相应格式，一般是用hapmap格式来着，要是软件上找不到对应格式，请反思自己想不开保存的是个啥格式（误）。

打开后应该如上图，最上方显示snp位点名称or位置；左侧显示自交系名称，表格内标注snp位点，其中黄色为主要位点，蓝色为次等位点，空白为数据缺失。
注：tassel好像不怎么对数据进行缺失质控，若需要质控可以通过plink进行质控（见gwas学习笔记）后导入

数据质控

选取snp数据后，在filter-sites打开snp位点质控面板，如下图

其中最为重要的是minimum frequency ，即设置maf质控的阈值，即小于阈值的次等基因进行筛选，点击remove minor snp states会把小于设置阈值的次等基因位点移除。
在filter-filter genotype table taxa 打开个体质控面板

其中min/max heterzygous proportion 控制杂合率，自行设置。
最为重要的质控部分就差不多了，其他质控部分根据需要调整

观察表型数据

选取玉米育种中一个很重要的ss-nss指标作为协变量

表型数据

我们选择表型中的area，ss-nss数据中的ss与ns数据，这个选择通过filter-traits进行

计算协变量

一般可以通过亲缘关系矩阵或pca结果作为协变量加入gwas，这里我们采用亲缘关系矩阵，通过analysis-relatedness-kinship构建

进行gwas 的数据拼图我们拿齐了

整合数据

将两个表现数据表与过滤后的基因型数据合并，通过data-intersect join实现

结果如图

进行gwas分析

选择kinship矩阵和合并后的数据，通过analysis-association-mlm进行分析，因为加入亲缘矩阵，所以用mlm，不加亲缘矩阵就用glm
然后让他跑啊跑完
（跑跑太慢了，我拿其他跑好的数据意思意思一下）
在输出的三个文件中寻找到有p列存在的数据表，一般是第二个文件

结果可视化

在results下选择Manhattan plot 和qq图（最重要的部分），等跑完就可以了

实话实话这个图画的还挺不好看的，可以用r语言画画曼哈顿图，然后标注基因marker

写在最后

把科研学习变成一件快乐的事情，就会快乐许多呢。
祝各位科研快乐~

2021年10月13日

基于GUS报告NtNRT1.2启动子的活性鉴定

一、实验材料

NtNRT1.2 Promoter::GUS的转基因烟草（根系）。实验使用的预测性启动子为NtNRT1.2基因编码的起始密码子上游2000bpDNA片段。

二、原理

GUS染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性，并进行化学定位的一种方法。GUS（β-glucuronidase）是一种报告基因，其来源于大肠杆菌，编码β-葡聚糖苷酶，这种酶可以催化底物5-溴-4-氯-3吲哚葡聚糖醛酸苷（X-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，以观察特定基因的表达。
通过在我们所研究基因的启动子后接上GUS基因，当我们所研究的基因表达，GUS基因也会随着表达，将植株通过X-Gluc进行染色后可显现深兰色，以此来显示特定基因的表达位置（图1）

三、实验步骤

1．种子的消毒灭菌
1. 将种子置于1.5mL离心管，加入70%乙醇表面消毒1-2分钟
2. 移去酒精，加入Bleach溶液（2%次氯酸钠+0.1%SDS），吹打几下后，浸泡15-20分钟
3. 在超净台中移去Bleach，使用无菌水清洗5遍以上，清洗时移液枪头插至离心管底，缓慢吸取液体
4. 清洗后的种子放置于培养皿内灭菌的滤纸上，晾干备用

2. 幼苗的平板培养

将置于滤纸上的拟南芥种子经过表面喷洒酒精消毒置于超净台中
双手进入超净台进行操作前佩戴橡胶手套，同时对双手、手臂以及所以放入超净台的物品（培养基、移液枪等）进行酒精喷洒消毒
待双手及所有物品上酒精蒸发后，点燃酒精灯，打开培养基，将镊子置于酒精灯火焰上灼烧至略红
将镊子拿离火焰，稍稍冷却后夹取牙签，用手拿取镊子夹住的一头
用牙签先微微沾取少量培养基，将滤纸上种子沾至牙签，点至培养基
点约20-25个种子，每个种子距约1cm
点种完毕后上覆盖子，用封口膜密封
4℃冰箱进行处理1-2天后于拟南芥培养室培养培养（21-22℃、光照16h/黑暗8h、关照强度80-120 微mol/(m-2s-1)），竖直放置待种子生长8-10天

注意事项

1.种子消毒时候应当进行吹打，使得消毒充分
2.吸取与液体时应当移液管枪头插入离心管底部，再缓慢吸取液体
3.所有物品包括双手、手臂进入超净台之前务必使用酒精消毒，避免污染
4.在超净台内点燃酒精灯前要确认超净台所有物品及双手上无肉眼可见酒精
5.超净台内镊子竖直放置
6.牙签拿取部位应该是镊子的夹取部位以保证另一端的无菌

3．GUS组织化学染色及显微镜观察

配置GUS染色液（共1mL）
将待处理的幼苗从培养基上取下放入染色液
于37℃培养箱黑暗处理12h以上
将染色好的幼苗置于70%酒精中脱色后于显微镜下观察

结果

1.拟南芥平板观察

其实最开始进行染色的是拟南芥，后来拟南芥染不上色，就用了染好的烟草来观察。
经过平板培养的拟南芥已生长出叶和较长的根，由于培养时候整个培养基竖直摆放，拟南芥根在培养基表匍匐生长，便于取出

2．染色烟草显微镜下观察

在肉眼下观察染色烟草根系，发现染色区域多集中于整根，侧根区域染色较少，且成熟的上部根系染色较为明显，而较为幼嫩的下部根系染色程度较低，甚至不染色（图2a），因此我们猜测，NtNRT1.2多在根系成熟成熟区域表达，由于根系成熟区域主要执行养分吸收功能，因此我们猜测NtNRT1.2应该与植物根系成熟区的氮吸收有关。
接下来我们将烟草根系置于低倍显微镜下进行观察，我们发现根系的中柱部分显示出大范围的染色，表面NtNRT1.2在中柱区域大量表达，而侧根原基区域并为显示出明显染色（图2b）；进一步在高倍镜下观察侧根，发现侧根没有显示出明显染色。

在观察的同时，我们发现在侧根的根尖出现了略微染色（图3a），观察其他烟草根系，并未发现侧根根尖染色的情况，在此植株的其他侧根上也较少发现类似现象，这一小概率现象还待进一步考证。同时我们观察到一个有趣的现象，在侧根与主根中柱的汇集处，染色程度较深，这可能是由于中柱较为集中导致的（图3b），但是我们也大胆的猜测，中柱的汇集处可能存在分配养分运输的机制，因此需要更多转运蛋白协调物质的中柱养分分配，因此与氮素营养运输有关的NtNRT1.2表达量增加

综上所述，烟草根系染色在主根区域较为明显，且较为成熟的区域颜色程度较高，染色的具体区域为中柱，因此，我们猜测NtNRT1.2定位于植物根系成熟区域的中柱，参与植物根系的氮的长距离运输。

讨论

正经人谁猜啊，我直接打开UniProt直接搜索NtNRT1.2蛋白，还真搜到了。

提交名称NRT1.2，由烟草（Common tobacco）NtNRT1.2-s基因表达，定位于膜，参与硝酸盐的跨膜运输，铵态氮的系吸收。也有证据表明其可能参与磷酸根离子和寡肽的运输。
进一步，我们又发现一篇刊于《frontiers in Plant Science》2018; 9: 210的文献，看了看这篇文献的作者，我一瞬间明白了我们可爱的刘老师为啥让我们做NtNRT1.2的GUS染色(Liu et al., 2018)。
通过不同的氮处理下，间隔一段时间测定烟草根系和叶片中的NtNRT1.2的表达，可以发现NtNRT1.2对于氮具有一定的反应，特别是硝态氮，随着硝态氮的输入，NtNRT1.2在一段时间后显著表达，且这种表达会受到氮缺乏的抑制（图4），因此不难猜测NtNRT1.2应当参与了植物根系硝酸盐反应

对植物根系一天内不同时间段内的NtNRT1/2的基因表达的测定表明NtNTR1.2在6:00与8:00达到表达高峰（图5），考虑到植物在夜间需要进行活跃的碳水化合物同化，此过程需要大量的氮素提供，因此这暗示我们NtNRT1.2应当与氮的吸收和运输相关

更进一步，通过在拟南芥nrt1.1-1突变体内转入NtNRT1.1与NtNRT1.2 的基因来验证其基因功能。半定量RT-PCR证明了NtNRT1.1/1.2在拟南芥中的表达，通过拟南芥叶片和根系鲜重的测定（图6），证明了NtNRT1.1/1.2显著提高突变体生长状况，间接证明了NtNRT1.2参与植物根系硝酸盐的吸收。

参考文献

Liu, L. H., Fan, T. F., Shi, D. X., Li, C. J., He, M. J., Chen, Y. Y., . . . Sun, Y. C. (2018). Coding-Sequence Identification and Transcriptional Profiling of Nine AMTs and Four NRTs From Tobacco Revealed Their Differential Regulation by Developmental Stages, Nitrogen Nutrition, and Photoperiod. Front Plant Sci, 9, 210. doi:10.3389/fpls.2018.00210

2021年10月13日2022年4月28日

全球干旱加剧下的植物胁迫记忆作用

写在最前面

大三上的时候上了一门课《全球变化生物学》，老师讲的挺有趣，我也十分感兴趣，就在课外阅读写相关文献，邻近期末了发现这些看过的文献竟然可以按照自己的理解串成一个故事，就试着写一写。

摘要

为了大家省时间快速康康我葫芦里在卖什么药，我直接上一份摘要。
在全球气候变暖的背景下，全球干旱呈现出更频繁、更持久的特点。而植物对于干旱胁迫具有“记忆”行为，这种行为的机理可能与信号物质的积累以及表观遗传的变化有关。这种记忆行为从个体上提高个体存活，通过雄性不育控制后代性别从而促进群体的存活，而我们可以通过育种、沟灌等方式利用植物的胁迫记忆。

一、全球气候变化背景

在人类的整个历史进程中，地球的气候都在不断发生变化，而这种气候变化的原因大多归于地球轨道上的微小变化。但是目前全球气候变暖的趋势具有与众不同的意义，其原因在于大量的证据表明，现代全球气候变暖现象很大可能源于19世纪中期以来的人类活动。根据NASA以及IPCC的第五次气候评估报告，全球温度自1880年观测升高了2.0℉；二氧化碳比例于工业革命前提高了47%（自185ppm升高到280ppm）。其结果导致了北极冰川以每十年13.1%的速度下降；南极冰盖以每年1490亿吨的质量流失；海平面以每年3.3mm的速率上升(Lindgren, 2014)。
对于全球农业生产，全球气候变暖的同时导致了全球极端气候发生的频率和强度增加，植物将面对更为严重和频繁的包括高温、干旱在内的气候胁迫。在这些胁迫之中，对于农业生产最为重要的胁迫为干旱胁迫。随着全球气候的变化，干旱胁迫一方面逐渐频繁；另一方面由于全球气温的增加，干旱的恢复周期不断增长（图1）。也就是说，植物必须面对更加频繁和持久的干旱胁迫。

关于这个干旱缺水，NASA做过一个美国的动图和预测，因为这里放不了动图，有兴趣的读者可以去搜搜。

二、植物干旱胁迫记忆

在关注全球干旱胁迫的同时，我们观察到植物对于干旱胁迫具有的“记忆行为”。在干旱胁迫中，我们注意到一些受到过干旱胁迫的植株，与未受到过干旱胁迫的植株相比，在下一次干旱胁迫来临时呈现出截然不同的表现（为受过胁迫的植株易萎蔫，而受过胁迫的植株正常生长）(Kinoshita & Seki, 2014)。植物的这种行为与人类的记忆呈现出一定的相似性，为了进一步探究这种有趣的现象，有研究对植物进行的持续的、间或的干旱胁迫。通过对野生拟南芥进行干旱胁迫，再进行浇水恢复生长，其中拟南芥的分离出正常生长与“迟缓生长”两种状态，进一步的，对“迟缓生长”的拟南芥表型施加持续不断的干旱胁迫和恢复，发现其与正常生长的拟南芥即使在相同生长条件下也呈现出了截然不同的生长状态，经过不断胁迫的拟南芥植株表现为“迟缓生长”的状态(Peter A. Crisp，Diep Ganguly, 2016)（图2）。
科学奖们将植物的这种类似于人类的记忆的植物生长行为称为植物胁迫记忆（plant stress memory），而这种有趣的植物生长现象背后的机理是所有植物研究工作者所关注的。

三、干旱胁迫记忆机理

1.胁迫记忆信号的积累

植物现状与植物基因的相关性已被揭示，为了研究干旱胁迫背后的机理，研究将重点指向了植物干旱胁迫响应过程中的基因表达的变化。通过培养经过不同干旱胁迫周期的拟南芥植株，在表型上观察到植株的保水性状随着干旱胁迫“训练”周期数的增加而不断增强（图3a、b）。因此，研究选取了与植物保水性状有关的代表性基因（RD29A、RD29B、COR15A、COR18），通过分析其在不断胁迫过程中的基因表达变化，得到RD29A、COR15A在不断的胁迫与恢复过程中呈现为震荡的状态（图4a、b）；而RD29B、COR18在不断的胁迫和恢复过程中呈现为逐渐波动上升的状态（图4c、d）。研究证明在植物干旱胁迫记忆的建立过程中，植物的某些基因的表达也形成了记忆机制(Ding, Fromm, & Avramova, 2012)。

在植物免疫记忆的研究中，发现了一类“信号放大器”，在植物产生免疫防御响应后再植物体内合成积累，当下一次免疫防御发生时，植物的免疫信号通过“信号放大器”进行快速传递和放大，使得植物体快速建立免疫防御(Conrath, 2011)。类比于植物免疫记忆的机理，研究对植物干旱胁迫记忆建立过程中的各种代谢物与转录因子进行了测定，发现在植物干旱胁迫的过程中，各种转录因子和基因都表达上升，而随着水分条件的改善，进入恢复期，大部分转录因子的表达回归到胁迫前，而一类持久调节的关键信号代谢物和转录因子在植物胁迫记忆的过程中持续保持的较高水平(Peter A. Crisp，Diep Ganguly, 2016)（图5）。因此，我们猜测在植物通过相关基因中间信号物质（或类似于“信号放大器”）的积累，实现了植物对于频繁干旱胁迫的快速响应和记忆。

2．表观遗传的变化

在对拟南芥的干旱胁迫实验便已发现，这个胁迫记忆具有一定程度上的可遗传性，对于环境引起的可遗传的性状，一个常用的解释方向便是表观遗传。因此研究开始关注表观遗传与干旱胁迫记忆的关系。
基于这个前提和假设，在对拟南芥的保水性状基因的研究上更近一步，使用一类组蛋白H3K4me3的甲基转移酶atx1，抑制组蛋白上的甲基化过程。通过实验发现，两类基因的表达量都发生了显著降低(Ding et al., 2012)（图6），这可以说明表观遗传过程（或者说甲基化过程）参与到了与胁迫记忆有关的基因的调控中。

在这时，MSH基因的发现，为研究植物干旱胁迫记忆提供了全新的工具。在植物干旱胁迫的过程中发现了MSH1基因的表达显著变化，随着进一步的研究发现MSH1对控制叶绿体和线粒体的基因温度性具有重要作用，且这种作用是通过控制叶绿体和线粒体基因的表观遗传实现。通过使用Ti质粒插入msh1基因（msh1-TDNA）、对msh1基因进行基因沉默（msh1-RNAi）构建拟南芥，与野生型（WT）以及具有胁迫记忆的拟南芥（msh1-memory）进行比较，通过测定发现在具有胁迫记忆的拟南芥植株中，msh1的表达显著降低（图7a、b）；更近一步，通过5-氮杂胞苷（DNA甲基化的一种抑制剂）处理上述的四类拟南芥植株，发现由msh1表达差异导致的表型差异（叶面积）消失（图7c、d），至此确认MSH1记忆通过甲基化作用影响植物干旱胁迫记忆(Yang et al., 2020)。

经过一系列的研究，科学家给出了MSH1控制表观遗传的机理，即外界胁迫（如干旱）抑制MSH1基因表达，从而导致线粒体内基因的DNA重排，分泌PEP至叶绿体，叶绿体产生WHY1至细胞核，细胞核接受信号介导细胞核的DNA甲基化（图8），从而使得植物在表观遗传上做出响应。(Mackenzie & Kundariya, 2020)

3.其他机理

除去信号物质的积累和表观遗传变化，植物干旱胁迫记忆或者广义上的植物胁迫记忆涉及到如植物激素、FLC基因（图9），这里便不进行展开。(Peter A. Crisp，Diep Ganguly, 2016)

四、干旱胁迫记忆的意义

植物建立的干旱胁迫记忆，一方面，使得其叶面积减少、保水能力增强，提升其在多变气候条件下的生存能力；另一方面，有研究指出干旱胁迫记忆的产生可以会对植物的生殖产生影响，从而提高整个群落在不稳定环境的生存能力。
这一作用过程可能涉及到MSH1基因的表达，且最先在烟草中观察到。通过基因沉默技术构建MSH1基因沉默的烟草，通过电泳验证了两者在MSH1基因表达上的差异，实验得到MSH1基因沉默的烟草植株生长功能受到抑制而导致雄性不育（图10）(Ajay Pal S. Sandhu, 2007)。在拟南芥的研究中也发现MSH1基因抑制而导致的雄性不育(Mackenzie & Kundariya, 2020)，这种对于胁迫的响应，我们将其理解为群体为了适应不稳定且恶劣的自然环境，而减少后代中的雄性个体，增加雌性个体，以增强后代群体的生殖能力，以便于整个群体的存活。

五、胁迫记忆的应用

1.利用MSH1基因选育雄性不育材料

随着现代生物技术的快速发展，利用基因工程选育雄性不育材料已经成为了植物雄性不育研究的热点之一。目前已知的雄性不育都是由于线粒体基因组的基因异常所致，而MSH1就是维持线粒体基因组稳定性的重要基因之一，因此通过控制MSH1基因的表达，理论能够实现对后代雄性不育的控制，加之这种技术可以得到稳定遗传的后代，在杂交种制种上具有可观的应用价值。

2.增强植物适应能力

有研究已经指出，通过将野生植株与MSH1表达抑制的植株体作为砧木（即具有胁迫记忆的植株）进行嫁接，得到的植株具有更高的活力（图11），且这种活力可遗传而可以扩大到田生产(Kundariya et al., 2020)。

3.指导农业生产

在农业生产中，沟灌是常常使用的一项沟灌技术，而干湿交替沟灌（SWDFI）、固定干湿沟灌（FWDFI）与传统沟灌法（TFI）相比（图12）具有更好的效果而被广泛采用，而其原理都为人为的制造局部干旱胁迫。有研究指出，干湿交替沟灌与传统沟灌相比在相同的灌溉水平下具有更高的产量和品质，且植物的水利用效率更高(Sarker et al., 2016)。

参考文献

Ajay Pal S. Sandhu, R. V. A., and Sally A. Mackenzie. (2007). Transgenic induction of mitochondrial rearrangements for cytoplasmic male sterility in crop plants. PNAS, February 6, 2007 104 (6) 1766-1770.

Conrath, U. (2011). Molecular aspects of defence priming. Trends Plant Sci, 16(10), 524-531. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21782492. doi:10.1016/j.tplants.2011.06.004

Ding, Y., Fromm, M., & Avramova, Z. (2012). Multiple exposures to drought 'train' transcriptional responses in Arabidopsis. Nat Commun, 3, 740. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22415831. doi:10.1038/ncomms1732

Kinoshita, T., & Seki, M. (2014). Epigenetic memory for stress response and adaptation in plants. Plant Cell Physiol, 55(11), 1859-1863. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25298421. doi:10.1093/pcp/pcu125

Kundariya, H., Yang, X., Morton, K., Sanchez, R., Axtell, M. J., Hutton, S. F., . . . Mackenzie, S. A. (2020). MSH1-induced heritable enhanced growth vigor through grafting is associated with the RdDM pathway in plants. Nat Commun, 11(1), 5343. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33093443. doi:10.1038/s41467-020-19140-x

Lindgren, M. (2014). Climate Change 2014 Synthesis Report Summary for PolicymakersChapter. IPCC, AR5.

Mackenzie, S. A., & Kundariya, H. (2020). Organellar protein multi-functionality and phenotypic plasticity in plants. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 375(1790), 20190182. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31787051. doi:10.1098/rstb.2019.0182

Peter A. Crisp，Diep Ganguly, S. R. E., Justin O. Borevitz and Barry J. Pogson. (2016). Reconsidering plant memory: Intersections between stress recovery, RNA turnover, and epigenetics. Science Advances, Vol. 2, no. 2, e1501340.

Sarker, K. K., Akanda, M. A. R., Biswas, S. K., Roy, D. K., Khatun, A., & Goffar, M. A. (2016). Field performance of alternate wetting and drying furrow irrigation on tomato crop growth, yield, water use efficiency, quality and profitability. Journal of Integrative Agriculture, 15(10), 2380-2392. doi:10.1016/s2095-3119(16)61370-9

Yang, X., Sanchez, R., Kundariya, H., Maher, T., Dopp, I., Schwegel, R., . . . Mackenzie, S. A. (2020). Segregation of an MSH1 RNAi transgene produces heritable non-genetic memory in association with methylome reprogramming. Nat Commun, 11(1), 2214. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32371941. doi:10.1038/s41467-020-16036-8

2021年10月13日2022年4月28日

[文献阅读]传递细胞介导硝酸盐吸收以控制根瘤共生

写在最前面

最近考试超多的好嘛，卷起来了，但又没完全卷。今天看了篇分子生物学的文章，觉得还挺有趣的，按自己的思路便写写看。文章为2020年的nature plants，题为Transfer cells mediate nitrate uptake to control root nodule symbiosis（具体见参考文献文献）

摘要

根瘤共生为植物提供了固氮的能力，从而提高作物产量。环境硝酸盐水平影响着根系结瘤和固氮，但是豆科植物调节硝酸盐吸收以调节根瘤共生的机制仍不清楚。通过鉴定苜蓿NPF家族的一个成员NPF7.6，观察到NPF7.6在根瘤维管组织中特异性表达，且定位于根瘤转移细胞的质膜上，在那里NPF7.6起到高亲和硝酸盐转运体的作用。进一步通过构建NPF7.6的突变体，使得突变体在根瘤维管组织发育异常，且表现出硝酸盐吸收减少、一氧化氮稳态紊乱和固氮酶活性减弱，基于此提出了NPF7.6参与根瘤调控的机制。(Wang et al., 2020)

一、传递细胞

传递细胞是一类特殊的薄壁细胞，在植物中一般位于维管组织内（图1a），起到转运营养物质的作用；其具有内折的质膜，形成许多指状不规则凸起以增大表面积（图1b），根瘤内的传递细胞也被称为NTCs

二、NPF7.6亚细胞定位和编码蛋白功能揭示

1．组织定位

（1）GUS染色

GUS 染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性，进行化学定位的一种方法。GUS（β-glucuronidase）是一种报告基因，其来源于大肠杆菌，编码β-葡聚糖苷酶，这种酶可以催化底物 5-溴-4-氯-3 吲哚葡聚糖醛酸苷（X-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，以观察特定基因的表达。通过在我们所研究基因的启动子（promoter）后接上 GUS 基因，当我们所研究的基因表达，其启动子被激活，GUS 基因也会随之表达，将植株通过 X-Gluc 进行染色后可显现深兰色，以此来显示特定基因的表达位置（图2）。

通过克隆NPF7.6的启动子并接上GUS基因构建pNPF7.6::GUS构建体，通过X-Gluc染色后可以观察到NPF7.6基因在根瘤维管组织内特异性表达（图3），植物基因的功能往往与基因的表达位置具有密切的关系，因此，这暗示我们NPF
7.6很可能与硝酸盐的运输有关。

（2）GFP亚细胞定位

GFP与GUS基因类似，都为报告基因，通过在苜蓿根的NPF7.6启动子后加入GFP基因，构建NPF7.6启动子驱动的NPF7.6::GFP构建体，GFP基因表达的蛋白可以显示出绿色荧光来显示基因的表达位置。
与GFP处理的对照组相比，BPF7.6::GFP的荧光定位于质膜（图4a），特别是在传递细胞向内凸起的细胞膜处（图4b），带有更亮的斑点，这表明NPF7.6定位于质膜部位，特别是细胞膜向内凸出的部位。通过三维重建荧光定位位置进一步揭示NTCs向内凸起细胞膜上的NFP7.6空间分布模式（图4c-d），我们可以观察到，NPF7.6很可能在根瘤共生期间在根瘤传递细胞上吸收硝酸盐，特别是传递细胞向内凸起的质膜上。

（3）编码蛋白功能验证

为了验证NPF7.6编码蛋白的作用，这里通过在卵母细胞中注射NPF7.6的cRNA进行评估，同时选取了高亲和的CHL1进行对比。在0.2和10mM的硝酸盐浓度下，NPF7.6的转运能力均低于CHL1，但是与对照组进行比较，NPF7.6表现出显著的硝酸盐转运能力（图5a）。进一步对NPF7.6进行动力学分析表明，对于硝酸盐的吸收，NPF7.6表现出具有饱和点的饱和动力学方式。因此，我们可以确定，NPF7.6编码高亲和的质膜定位的硝酸盐转运体。
与此同时，我们发现了NPF7.6的活性可以通过植物根瘤的定殖以及外界硝酸盐的浓度变化（图5c），这暗示我们NPF7.6很可能参与根瘤对于外界硝酸盐浓度的感应并调控根瘤的生长发育。

三、NPF7.6基因功能确认

1．NPF7.6突变体的构建

为了获得NPF7.6在根瘤共生中的作用，我们使用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除NPF7.6得到两个突变体（npf7.6-1、npf7.6-2），他们在NPF7.6基因第一个的第一个外显子区域存在突变。

2．NPF7.6突变体表型性状差异

将得到的NPF7.6突变体与野生型（R108）在不同硝酸盐浓度下培养以观察野生型与突变体对于外界硝酸盐的浓度。在表型上，NPF7.6突变体在高氮条件下表现为根结较短，而在低氮条件下表现为更大的根结，且保留高氮条件下的粉色表型（图7a）。进一步对根瘤的鲜重、根瘤长度和根瘤数目进行测定，数据表明NPF7.6的突变体与野生型相比在鲜重和根瘤长度方面变化的范围缩小（图7b-d），这表明NPF7.6的缺失导致了植物根系对于外界硝酸盐浓度的反应迟缓

进一步，我们根瘤进行横切以观察突变体在维管组织发育上的不同。对根瘤切片的扫描电镜显示，NPF7.6突变体的根瘤维管组织与对照组相比更为分散而显示为一种异常的维管组织发育模式（图8A-B）。我们已经指出了NPF7.6定位于传递细胞质膜，传递细胞最为特殊的为向内凸起的质膜，因此我们通过扫描电镜观察了突变体的传递细胞内突部位，并通过3D重建野生型和突变体的传递细胞内突结构。对照组R108中的传递细胞具有复杂结构的质膜内突，并伴有线粒体和广泛的内质网；与野生型光滑的内突相比，突变体内突表面呈现出夸张的锯齿状（图8C-D）。
这些证据表明，定位于传递细胞质膜的NPF7.6很可能通过调控硝酸盐的吸收来调控根瘤维管组织的表型可塑性。

四、NPF7.6调控机制的揭示

为揭示NPF7.6在根瘤共生中的调节机制，我们先对根瘤硝酸盐吸收进行探索。我们通过向根瘤表面添加N15标记的硝酸盐来模拟根瘤吸收外界硝酸盐的过程；同时向距根瘤2cm的根部区域添加N15标记的硝酸盐模拟根瘤从根系中吸收硝酸盐的过程，在添加硝酸盐2h后收集并测定根瘤中的N15含量。结果显示，缺失NPF7.6功能的突变体缺失了从根系中吸收硝酸盐的能力，同时从外界环境吸收硝酸盐的能力也有显著降低（图9a-b）。这些证据同时也证明了根瘤从外界和宿主根部吸收和运输硝酸盐需要NPF7.6。
基于NPF7.6对于根系吸收硝酸盐的功能，我们提出以下可能的机制：在无氮条件下，根瘤诱导NPF7.6的表达，使得根瘤可以从宿主根系中吸收硝酸盐以维持自身生长；低氮条件下，NPF7.6被大量表达，促进根系对于外界硝酸盐的吸收以缓解根瘤与宿主根系对于硝酸盐的竞争；而在高氮条件下，过量表达的NPF7.6使得胞内硝酸盐浓度升高而抑制了根瘤的生长（图9c）

NPF7.6在高氮条件下对于根瘤生长的抑制机理并未清楚，我们尝试从转录组方面选择可能的机理。通过转录组的分析我们发现了一类Lb蛋白的表达变化，这类蛋白是根瘤中最为丰富的蛋白质，具有维持NO稳态，保持硝酸盐活性的作用，以此为线索，我们发现了参与编码Lbs的11个基因中发生了9个基因的显著下调（图10a）；为了进一步确定Lbs的下调是否导致了NO的变化，我们通过DAF-2-DA方法进行了NO的染色，实验表明NO在突变体中表现为广泛的累积（图10b），NO荧光强度显著提高（图10c）。而NO的积累会显著降低固氮酶的活性，从而抑制了根瘤的生长。另外，胞外实验已经表明，高浓度的硝酸盐具有显著抑制Lb基因表达的作用

基于以上的证据，我们提出如下的高氮调控机制：在高氮条件下，过量表达的NPF7.6导致对于硝酸盐的过量吸收，从而导致胞内硝酸盐浓度的大量累积。高浓度的硝酸盐抑制了Lbs基因的表达，间接导致了NO的积累，从而抑制固氮酶的活性，根瘤的生长因此受到抑制（图11）

五、讨论

在拟南芥中，鉴定出两个硝酸盐转运家族NRT1、NRT2，前者更名为NPF家族。NPF家族的功能已经过大量的研究，在如uniprot在线平台可以检索其家族蛋白质的功能。对于NPF家族的功能研究，主要有以下方面：NPF在结节形成、结节器官发生中起核心作用；是表皮细胞中诱导皮层细胞分裂导致结节原基形成所必需的(Rival et al., 2012)；NPF参与结瘤前识别根瘤菌的第一步(Amor B.B., 2003)；NPF在根瘤与苜蓿根瘤菌共生期间需要通过触发感染线并将细菌释放到发育中的根瘤感染区的细胞质中(Moling et al., 2014)。
在拟南芥、水稻、玉米等作物中发现了大量的NPF家族基因，它们在硝酸盐吸收上都发挥着类似功能，这也为我们提供了研究基因功能的思路，先寻找同源基因的功能并基于此猜测和验证基因功能。

六、参考文献

Amor B.B., S. S. L., Oldroyd G.E.D., Maillet F., Penmetsa R.V., Cook D., Long S.R., Denarie J., Gough C. (2003). The NFP locus of Medicago truncatula controls an early step of Nod factor signal transduction upstream of a rapid calcium flux and root hair deformation. the plant journal, 34(4), 495-506.

Moling, S., Pietraszewska-Bogiel, A., Postma, M., Fedorova, E., Hink, M. A., Limpens, E., . . . Bisseling, T. (2014). Nod factor receptors form heteromeric complexes and are essential for intracellular infection in medicago nodules. Plant Cell, 26(10), 4188-4199. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25351493. doi:10.1105/tpc.114.129502

Rival, P., de Billy, F., Bono, J. J., Gough, C., Rosenberg, C., & Bensmihen, S. (2012). Epidermal and cortical roles of NFP and DMI3 in coordinating early steps of nodulation in Medicago truncatula. Development, 139(18), 3383-3391. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22874912. doi:10.1242/dev.081620

Wang, Q., Huang, Y., Ren, Z., Zhang, X., Ren, J., Su, J., . . . Kong, Z. (2020). Transfer cells mediate nitrate uptake to control root nodule symbiosis. Nat Plants, 6(7), 800-808. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32514144. doi:10.1038/s41477-020-0683-6

2021年10月13日2022年4月28日

植物ICP数据的综合分析

引言

我们要对植物内元素含量进行测定，因此就直接上了ICP。实验中植物使用了微波消解法与干灰化法两种方法（具体试验步骤见同一文集的推文）。得到的机读数据如下。

library(xlsx)
library(readxl)
setwd("C:/Users/Administrator/Desktop/已办/土壤植物环境下/土壤植物环境分析实验-ICP/微波消解法")
shuju_ICP<-read_xls("20210512-微波消解.xls")
names(shuju_ICP)[1:2]<-c("处理","样品号")
shuju_ICP

处理    样品号  B 249.677 Ca 317.933 Cu 327.393 Fe 238.204  K 766.490 Mg 285.213 Mn 257.610 Na 589.592   P 213.617 Zn 206.200
1   ck1 Sample011 0.005 mg/L 8.215 mg/L 0.064 mg/L 0.182 mg/L 0.714 mg/L 0.996 mg/L 0.005 mg/L 1.025 mg/L -0.145 mg/L 0.139 mg/L
2   ck2 Sample012 0.009 mg/L 5.202 mg/L 0.061 mg/L 0.168 mg/L 0.442 mg/L 0.479 mg/L 0.004 mg/L 1.050 mg/L -0.158 mg/L 0.040 mg/L
3     1 Sample013 0.072 mg/L 64.31 mg/L 0.151 mg/L 13.05 mg/L 156.4 mg/L 23.16 mg/L 0.620 mg/L 4.375 mg/L  32.23 mg/L 0.507 mg/L
4     2 Sample014 0.085 mg/L 70.85 mg/L 0.151 mg/L 5.475 mg/L 117.9 mg/L 18.36 mg/L 0.422 mg/L 2.577 mg/L  28.99 mg/L 0.538 mg/L
5     3 Sample015 0.072 mg/L 66.55 mg/L 0.054 mg/L 4.136 mg/L 119.3 mg/L 18.37 mg/L 0.419 mg/L 2.319 mg/L  31.56 mg/L 0.390 mg/L
6     4 Sample016 0.070 mg/L 61.66 mg/L 0.123 mg/L 13.34 mg/L 153.8 mg/L 23.78 mg/L 0.692 mg/L 3.008 mg/L  33.31 mg/L 0.479 mg/L
7     5 Sample017 0.073 mg/L 63.93 mg/L 0.126 mg/L 13.77 mg/L 156.5 mg/L 24.11 mg/L 0.634 mg/L 2.993 mg/L  32.91 mg/L 0.477 mg/L
8     6 Sample018 0.085 mg/L 72.04 mg/L 0.148 mg/L 5.476 mg/L 121.8 mg/L 18.36 mg/L 0.419 mg/L 4.261 mg/L  28.50 mg/L 0.621 mg/L
9     7 Sample019 0.072 mg/L 61.74 mg/L 0.140 mg/L 13.67 mg/L 156.7 mg/L 24.06 mg/L 0.591 mg/L 3.870 mg/L  31.92 mg/L 0.448 mg/L
10    8 Sample020 0.073 mg/L 61.38 mg/L 0.144 mg/L 12.64 mg/L 146.8 mg/L 22.76 mg/L 0.666 mg/L 3.046 mg/L  33.00 mg/L 0.537 mg/L
11    9 Sample021 0.090 mg/L 69.35 mg/L 0.101 mg/L 5.636 mg/L 124.6 mg/L 19.29 mg/L 0.433 mg/L 2.150 mg/L  29.62 mg/L 0.398 mg/L
12   10 Sample022 0.067 mg/L 69.30 mg/L 0.176 mg/L 13.61 mg/L 153.6 mg/L 24.18 mg/L 0.608 mg/L 3.862 mg/L  32.34 mg/L 0.503 mg/L
13   11 Sample023 0.068 mg/L 59.15 mg/L 0.110 mg/L 12.85 mg/L 152.8 mg/L 23.42 mg/L 0.604 mg/L 3.103 mg/L  32.49 mg/L 0.429 mg/L
14   12 Sample024 0.067 mg/L 61.64 mg/L 0.137 mg/L 13.21 mg/L 155.4 mg/L 23.95 mg/L 0.595 mg/L 3.238 mg/L  31.65 mg/L 0.462 mg/L
15   17 Sample025 0.086 mg/L 66.45 mg/L 0.112 mg/L 5.685 mg/L 122.8 mg/L 18.11 mg/L 0.429 mg/L 2.005 mg/L  28.42 mg/L 0.406 mg/L
16   18 Sample026 0.071 mg/L 75.88 mg/L 0.215 mg/L 13.46 mg/L 156.8 mg/L 24.84 mg/L 0.611 mg/L 6.337 mg/L  31.99 mg/L 0.513 mg/L
17   19 Sample027 0.069 mg/L 61.68 mg/L 0.123 mg/L 13.14 mg/L 158.0 mg/L 23.98 mg/L 0.629 mg/L 3.025 mg/L  33.54 mg/L 0.462 mg/L
18   20 Sample028 0.089 mg/L 78.73 mg/L 0.164 mg/L 5.250 mg/L 122.7 mg/L 18.97 mg/L 0.424 mg/L 3.248 mg/L  28.65 mg/L 0.511 mg/L
19   21 Sample029 0.071 mg/L 59.89 mg/L 0.117 mg/L 13.22 mg/L 151.1 mg/L 23.20 mg/L 0.635 mg/L 2.743 mg/L  32.82 mg/L 0.449 mg/L
20   22 Sample030 0.070 mg/L 66.57 mg/L 0.164 mg/L 12.67 mg/L 158.5 mg/L 24.35 mg/L 0.605 mg/L 3.423 mg/L  33.06 mg/L 0.455 mg/L
21   23 Sample031 0.075 mg/L 70.88 mg/L 0.195 mg/L 4.250 mg/L 134.5 mg/L 21.61 mg/L 0.432 mg/L 4.883 mg/L  34.66 mg/L 0.447 mg/L
22   24 Sample032 0.071 mg/L 70.40 mg/L 0.209 mg/L 13.25 mg/L 161.7 mg/L 25.22 mg/L 0.599 mg/L 7.407 mg/L  32.50 mg/L 0.470 mg/L
23   25 Sample033 0.074 mg/L 63.17 mg/L 0.121 mg/L 13.32 mg/L 161.8 mg/L 24.87 mg/L 0.590 mg/L 3.567 mg/L  32.09 mg/L 0.452 mg/L
24   26 Sample034 0.101 mg/L 69.16 mg/L 0.112 mg/L 5.264 mg/L 126.7 mg/L 20.21 mg/L 0.417 mg/L 2.975 mg/L  29.20 mg/L 0.411 mg/L

数据提取

观察干灰化法与微波分解法的ICP原始数据，发现数据采用类似的格式，即为“数值+空格+ mL/L”的数据格式。根据此项数据格式，以空格划分数据，提取数值部分。

shuju2_ICP<-data.frame(shuju_ICP[1])

for(a in c(3:12)){
  c<-c()
  for(i in shuju_ICP[[a]]){
    string<-strsplit(i,split = " ")
    string<-unlist(string)[1]
    string<-as.numeric(string)
    c<-c(c,string)
  }
  shuju2_ICP<-data.frame(shuju2_ICP,c)
}
names(shuju2_ICP)[-1]<-names(shuju_ICP)[3:12]
print(shuju2_ICP)

数据输出如下

> head(shuju2_ICP)
  处理 B 249.677 Ca 317.933 Cu 327.393 Fe 238.204 K 766.490 Mg 285.213 Mn 257.610 Na 589.592 P 213.617 Zn 206.200
1  ck1     0.005      8.215      0.064      0.182     0.714      0.996      0.005      1.025      0.00      0.139
2  ck2     0.009      5.202      0.061      0.168     0.442      0.479      0.004      1.050      0.00      0.040
3    1     0.072     64.310      0.151     13.050   156.400     23.160      0.620      4.375     32.23      0.507
4    2     0.085     70.850      0.151      5.475   117.900     18.360      0.422      2.577     28.99      0.538
5    3     0.072     66.550      0.054      4.136   119.300     18.370      0.419      2.319     31.56      0.390
6    4     0.070     61.660      0.123     13.340   153.800     23.780      0.692      3.008     33.31      0.479

观察数据的两个CK部分，发现存在负值的数据值，将负值的数据值人为调整为0。

for(a in c(1:2)){
  for(b in c(2:11)){
    if(shuju2_ICP[a,b]<0){
      shuju2_ICP[a,b]<-0
    }}}
shuju_CK<-shuju2_ICP[1:2,]
print(shuju_CK)

输出CK组数据

> shuju_CK
  处理 B 249.677 Ca 317.933 Cu 327.393 Fe 238.204 K 766.490 Mg 285.213 Mn 257.610 Na 589.592 P 213.617 Zn 206.200
1  ck1     0.005      8.215      0.064      0.182     0.714      0.996      0.005      1.025         0      0.139
2  ck2     0.009      5.202      0.061      0.168     0.442      0.479      0.004      1.050         0      0.040

依照土植环实验的经验，将所有数据按如下方式进行分组：1组（1、4、7、10、19、22、25号）、2组（2、5、8、11、20、23、26号）、3组（3、6、9、12、21、24号）。其中以下的数据分析只使用微波消解法数据，原因在于缺少各组样品质量的数据，而干灰化法的称量处于0.3000-0.3500g的范围；微波消解的称量范围为0.2990-0.3010g，相比而言用微波消解法的溶液浓度数据当做植物元素浓度数据具有更小的误差并具有分析意义，因此，我们假设微波消解法各组样品的称样量为0.3000g，同一组内具有多个重复。

group_1<-seq(from=1,to=26,by=3)
group_2<-seq(from=2,to=26,by=3)
group_3<-seq(from=3,to=26,by=3)
shuju2_ICP<-within(shuju2_ICP[-1:-2,],{
                   组别<-NA
                   组别[处理%in% group_1] <- 1
                   组别[处理%in% group_2] <- 2
                   组别[处理%in% group_3 ]<- 3
                     })
shuju2_ICP<-data.frame(shuju2_ICP[12],shuju2_ICP[1],shuju2_ICP[2:11])
print(shuju2_ICP)

提取的样品数据根据1-12号样品扣除CK1,17-26号样品扣除CK2得到扣除空白的数据列表

shuju2_ICP$处理<-as.numeric(shuju2_ICP$处理)
for(b in c(3:12)){
  for(a in c(1:22)){
    if(shuju2_ICP[a,2]<=14){
      shuju2_ICP[a,b]<-shuju2_ICP[a,b]-shuju_CK[1,b-1]
    }else{
      shuju2_ICP[a,b]<-shuju2_ICP[a,b]-shuju_CK[2,b-1]
    }}}
print(shuju2_ICP)

进行到这里，数据提取与整理完毕，如下显示最后提取的数据

> shuju2_ICP
   组别 处理 B.249.677 Ca.317.933 Cu.327.393 Fe.238.204 K.766.490 Mg.285.213 Mn.257.610 Na.589.592 P.213.617 Zn.206.200
3     1    1     0.067     56.095      0.087     12.868   155.686     22.164      0.615      3.350     32.23      0.368
4     2    2     0.080     62.635      0.087      5.293   117.186     17.364      0.417      1.552     28.99      0.399
5     3    3     0.067     58.335     -0.010      3.954   118.586     17.374      0.414      1.294     31.56      0.251
6     1    4     0.065     53.445      0.059     13.158   153.086     22.784      0.687      1.983     33.31      0.340
7     2    5     0.068     55.715      0.062     13.588   155.786     23.114      0.629      1.968     32.91      0.338
8     3    6     0.080     63.825      0.084      5.294   121.086     17.364      0.414      3.236     28.50      0.482
9     1    7     0.067     53.525      0.076     13.488   155.986     23.064      0.586      2.845     31.92      0.309
10    2    8     0.068     53.165      0.080     12.458   146.086     21.764      0.661      2.021     33.00      0.398
11    3    9     0.085     61.135      0.037      5.454   123.886     18.294      0.428      1.125     29.62      0.259
12    1   10     0.062     61.085      0.112     13.428   152.886     23.184      0.603      2.837     32.34      0.364
13    2   11     0.063     50.935      0.046     12.668   152.086     22.424      0.599      2.078     32.49      0.290
14    3   12     0.062     53.425      0.073     13.028   154.686     22.954      0.590      2.213     31.65      0.323
15    2   17     0.077     61.248      0.051      5.517   122.358     17.631      0.425      0.955     28.42      0.366
16    3   18     0.062     70.678      0.154     13.292   156.358     24.361      0.607      5.287     31.99      0.473
17    1   19     0.060     56.478      0.062     12.972   157.558     23.501      0.625      1.975     33.54      0.422
18    2   20     0.080     73.528      0.103      5.082   122.258     18.491      0.420      2.198     28.65      0.471
19    3   21     0.062     54.688      0.056     13.052   150.658     22.721      0.631      1.693     32.82      0.409
20    1   22     0.061     61.368      0.103     12.502   158.058     23.871      0.601      2.373     33.06      0.415
21    2   23     0.066     65.678      0.134      4.082   134.058     21.131      0.428      3.833     34.66      0.407
22    3   24     0.062     65.198      0.148     13.082   161.258     24.741      0.595      6.357     32.50      0.430
23    1   25     0.065     57.968      0.060     13.152   161.358     24.391      0.586      2.517     32.09      0.412
24    2   26     0.092     63.958      0.051      5.096   126.258     19.731      0.413      1.925     29.20      0.371

异常值的剔除与各组数据集中程度的衡量

数据异常值的剔除

这里我们使用箱型图来检测异常值，通过对微波消解法各组数据进行箱型图的绘制，以小于Q1-1.5IQR或大于Q3+1.5IQR作为异常值的划定标准，检测到四个异常值并在箱型图上进行标注。对于检测出的异常值，我们较为保守的进行了保留。

par(mfrow=c(2,5))
for(i in c(3:12)){
  box<-boxplot(shuju2_ICP[[i]]~shuju2_ICP[[1]],data = shuju2_ICP,
          main=names(shuju2_ICP)[i],
          xlab = "组别",
          ylab = "溶液浓度")
  out.vals=box$out
  for (a in out.vals) {
    text(a,adj = -0.2,labels = a)
  }
}

在Mn和Na组分别检测到了1个和2个异常值。我们发现报告异常值大多来自于Na的测定，我们猜测是由于Na的污染（如汗液）导致Na组异常值偏多。
通过箱型图可以得到在大部分的元素测定数据中，1组数据具有较其他两组数据更好的集中程度

正态性检验

library(car)
par(mfrow=c(2,2))
shuju2_ICP$组别<-as.character(shuju2_ICP$组别)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$B.249.677~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[3],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Ca.317.933~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[4],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Cu.327.393~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[5],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Fe.238.204~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[6],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$K.766.490~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[7],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Mg.285.213~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[8],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Mn.257.610~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[9],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Na.589.592~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[10],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$P.213.617~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[11],labels=F)
qqPlot(lm(shuju2_ICP$Zn.206.200~shuju2_ICP$组别),
      simulate = T,main=names(shuju2_ICP)[12],labels=F

方差齐次分析我们这里进行了偷懒，因为单因素方差分析对于方差是否齐次并不敏感，即使不通过方差齐次性检验，还是建议通过aov方法进行单因素方差分析

单因素方差分析

attach(shuju2_ICP)
data_result1<-aov(B.249.677~组别)
summary(data_result1)
data_result2<-aov(Ca.317.933~组别)
summary(data_result2)
data_result3<-aov(Cu.327.393~组别)
summary(data_result3)
data_result4<-aov(Fe.238.204~组别)
summary(data_result4)
data_result5<-aov(K.766.490~组别)
summary(data_result5)
data_result6<-aov(Mg.285.213~组别)
summary(data_result6)
data_result7<-aov(Mn.257.610~组别)
summary(data_result7)
data_result8<-aov(Na.589.592~组别)
summary(data_result8)
data_result9<-aov(P.213.617~组别)
summary(data_result9)
data_result10<-aov(Zn.206.200~组别)
summary(data_result10)

各元素数据方差分析结果（只显示最终结果）		B	Ca	Cu	Fe	K	Mg	Mn	Na	P	Zn
Pf(>F)	0.0736	0.391	0.988	0.0348	0.0217	0.0562	0.0572	0.37	0.202	0.986
*	*

备注：标注*为差异显著（95%）；标注**为差异极显著（99%）

多重比较

使用TukeyHSD方法

par(mfrow=c(1,2))
tuk_Fe<-aov(shuju2_ICP$Fe.238.204~shuju2_ICP$组别)
tuk_Fe<-TukeyHSD(tuk_Fe)
plot(tuk_Fe)
tuk_k<-aov(shuju2_ICP$K.766.490~shuju2_ICP$组别)
tuk_k<-TukeyHSD(tuk_k)
plot(tuk_k)

2021年10月13日2022年4月28日

[文献阅读]多样性激发的确定性细菌装配过程限制了群落功能

这里写写摘要

本文通过梯度稀释法产生了不同微生物多样性的细菌群落，并通过测序研究生物多样性与群落装配、群落功能的影响，并推测其潜在的功能性状。通过系统发育零模型分析，表明了随机装配在高多样性群落中的主导地位；低多样性群落中确定性装配的主导地位，同时这种确定性装配导致了特定功能的丢失，从而限制了群落功能。

实验背景

由于土壤微生物复杂以及难以培养的特性，使得对微生物多样性与生态功能的研究十分困难，自Whittaker提出生物多样性的概念后，为土壤微生物的研究提供了全新的研究思路。随着不断的研究，越来越多的证据已经指出，微生物的α多样性（即样本群落内的生物多样性）对生态系统的功能具有重要作用，而对于β多样性（即多个样本群落间的生物多样性）的影响关注较少，事实上β多样性对于推断土壤生物的群落装配过程是随机性还是确定性的具有重要意义。
微生物群落是陆地生态系统的重要组成部分，微生物的活动极大地影响了生态系统的功能及其稳定性。在生态学上，具有一个普遍的假设，即包含众多物种的生态系统具有高度的稳定性和生态系统功能，基于此提出物种功能的重叠为生态系统的稳定性提供了一些冗余与缓存，但是即便如此，我们对于和多样性有关的细菌群落如何相互作用调节生态系统功能和群落装配所知甚少。
在自然条件下，微生物群落的生长受到各种因素的影响，根据研究指出，土壤微生物多样性受到pH、土壤类型、纬度、植被、湿度、温度和养分的强烈影响，其中pH值是土壤多样性和丰度最佳的预测指标。一般来说，我们将土壤微生物多样性和功能的产生称为群落装配过程，其过程反映了群落组成的时空聚集过程，可以分为确定性和随机性过程。
基于已有的研究，本研究从微生物多样性出发，通过改变土壤微生物的多样性，分析其群落结构的组成和丰度差异（α多样性），进而观察生物多样性的不同对生态系统功能的影响；同时通过不同生物多样性的微生物群落结果的比较（β多样性）尝试分析土壤微生物的装配过程。

论文思路和方法

论文思路

通过将不同稀释浓度的土壤浸出液接种到灭菌处理的不同pH培养基，人为制造土壤微生物生物多样性的差异，培养16周后进行测序。先通过香农多样性（衡量α多样性的一种参数）观察不同处理的多样性差异；之后在影响微生物多样性的因素中选取具有代表性的pH、土壤类型、养分因素，进行变异分析，寻找导致多样性差异的主要因素。再通过|βNTI|（衡量β多样性的一种参数）比较不同处理间的差异，进而分析其群落装配过程是否为随机性装配过程。最后分析与生态系统功能有关的各类基因的表达差异，尝试分析微生物生物多样性的不同是否导致了生态系统功能的不同。即文章以以下思路展开：人为稀释显著降低生物多样性；生物多样性的降低触发了群落的确定性装配；群落的确定性装配会在一定程度上影响微生物群落的生态系统功能

实验方法

1.土壤选取和实验处理

移取土壤稀释液所用的土壤分别为黑土与红壤，按照土壤分类，其分别为钙质黑钙土、铁铝始成土（具体原始土壤土壤参数见下表1）。两种土壤一部分经过2mm筛后与室温下维持于恒定水分（田持30%），另一部分通过γ射线消毒。无菌土壤进行预实验，确定调节pH所需的CaO、FeSO4量。通过20g新鲜土样与180ml无菌水得到10-1稀释浓度，根据10-1稀释浓度稀释液得到10-4、10-7、10-10稀释梯度（图1），同时通过CaO、FeSO4获得pH梯度4.5、5.5、6.5、7.5、8.5（具体使用量见下表2）。共252个水平，其中5个pH处理×4个稀释处理×2个土壤类型+2个初始土壤处理，每个土壤处理6个重复。于20℃、45%田持条件下培养，每两周测定pH与Ca、Fe、SO4浓度，共培养16周。

表1：实验用原始土壤的土壤参数

土壤类型	pH	有机质%	N mg/kg	P mg/kg	K mg/kg
黑土	8.0	4.6	100.8	16.7	90.5
红壤	5.3	1.6	53.9	0.95	61.5

2.DNA提取和测序

培养16周后进行DNA提取，采用提取试剂盒，每个处理取两个重复，即三个重复提取DNA进行混合以最大限度减少误差。先在分光光度计260/280nm与260/230nm波长下评估提取DNA的质量。将通过评估的提取DNA在引物作用下进行PCR扩增，采用的16S rRNA扩增技术，对扩增细菌的16S rRNA V4高变区域进行扩展测序。测序数据进行质控后以97%的相似性进行聚类形成OTU以便后续分析；而其基因功能通过比对基因数据库进行基因功能注释。

3.数据分析

基于测序得到的OTU表，通过计算机程序得到香农多样性与NMDS分析；综合测定的pH、Ca、Fe、SO4浓度可以进行VPA（方差分解分析）得到土壤类型、pH、Ca、Fe、SO4浓度对于细菌群落变化的贡献。不同处理的比较（β多样性的比较）通过Unifrac方法进行（使用邓肯方法进行显著性比较），但为了推断群落的装配过程，引入参数βNTI，其中|βNTI|<2表明所观察到的系统发育组成的差异是随机过程的结果。基因功能的比较采用构建相对丰度的热图，数据来源于红壤的宏基因组测序，其中相对丰度指的是隶属于该功能组的序列数除以每个样本的总序列数，其结果以热图显示。

实验结果

1．重新组装细菌群落的系统分类特征

稀释对于重新装配细菌群落的组成具有显著的影响（图2a、b），同时pH对群落的组成也具有一定影响，在基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度(NMDS)中，不同稀释浓度的土壤群落在横坐标上分离，而不同pH的土壤群落在纵坐标上分离（图2a），表明稀释与pH对土壤微生物群落的重新装配具有最为显著的影响。将pH与稀释浓度作为横纵坐标的香农分析得出，香农多样性随着稀释浓度的增加而降低；而pH上，香农多样性在pH为中性的条件下处于较高水平（图2b）。

对不同pH下的黑土与红壤进行加权的UniFrac群落相异度分类分析得出两种土壤都在不同稀释浓度下表现出较大差异，且随着稀释浓度的增大，差异也随之增大（图3a）；以土壤类型进行比较得出不同土壤类型在不同稀释浓度上也存在着较大差异（图3b）。到此说明了虽然稀释的影响细菌群落结果的最大因素，但是pH与土壤类型对其也具有一定的影响。
通过变异分解分析（VPA）对土壤类型、pH与Ca、Fe、SO4浓度对于群落结构差异的相对贡献进行评价（图3c-h）。随着稀释浓度的增大，土壤类型的贡献逐渐降低；而pH的影响逐渐增大；Ca、Fe、SO4浓度的影响较小，可以忽略。
$图3.土壤微生物群落的加权Unifrac距离与VPA分析：a.在不同稀释水平下，黑土和红土中不同pH值的成对菌群的加权Unifrac距离；b.黑土和红土样品在不同稀释程度下成对细菌群落的加权Unifrac距离；c-h.土壤类型(ST)、土壤pH (pH)和Ca、Fe浓度(CONC)之间的变异分解分析(VPA)。$

2．细菌群落的装配过程

3．重新装配细菌群落的潜在的功能

为了评估各处理的生态功能，对红壤样品提取通过鸟枪法进行宏基因组测序，选取与生态系统有关的一些基因，测定其相对表达丰度。在选定的基因内，一部分基因分布在特定的微生物，如与“硫代谢”“氮代谢”等有关的“特异性功能基因”，我们暂且将其称为FunGP1,。这类基因大部分随着稀释梯度的增加而显著降低；而另一类具有广义功能定义（如“TCA循环”、“糖酵解”有基因）的基因（暂且称为FunGP2）随着稀释梯度的增加，其相对表达量显著升高。（图5a）。尽管FunGp1和FunGp2的相对丰度存在这些相反的模式，各功能类群的多样性随稀释程度的增加呈下降趋势（图4b），且相较于FunGp2(图4c),FunGp1(图4b)的功能多样性下降幅度更大。
为了进一步研究细菌多样性的影响以及确定性或随机性装配过程对代谢功能的相对丰度(FG RA）与多样性（FG Div）的影响，通过计算|βNTI |及其对应的香农多样性指数、FG RA与FG Div之间的相关性(图5d)。发现FunGp1的功能性状多样性和相对丰度、FunGp2的功能性状多样性与Shannon多样性呈正相关，与|βNTI |值呈负相关；而FunGp2的功能性状相对丰度则与Shannon多样性呈负相关，与|βNTI |值呈正相关。

4．细菌群落装配过程的概念模型

综上所述，我们可以看到，随着认为的制造稀释梯度与pH梯度，使得土壤微生物多样性随着稀释梯度的增加而降低，这种微生物多样性的降低使得土壤微生物在重新装配的过程中去趋向于确定性装配过程。而观察这个过程中的基因变化，我们可以发现，随着确定性的装配过程（即低水平的微生物多样性），具有广义功能定义的基因相对表达升高，而具有特异性功能定义的基因相对表达下降，这种结果可能会在一定程度上限制土壤微生物的生态系统功能。

基于这个研究，提出了细菌群落装配过程的概念模型（图6），其解释了与微生物多样性相关的确定性或随机性装配过程如何在不同pH条件下促进细菌群落的结构和功能的装配。

第一部分:高多样性的群落装配。在高生物多样性的阶段内，土壤中含有大量复杂且无法被大多数微生物利用的底物，当环境中的营养物质不足以支持大量微生物时，竞争加剧，而包含“硫代谢”、“氮代谢”等特异性功能的微生物群落，对于分解土壤养分，维持土壤养分循环而潜在地削弱生物竞争起到了重要作用。

第二部分：pH中性土壤中低生物多样性群落装配。在中性环境中大部分微生物都可以生存，这便导致了栖息地对于微生物的选择作用减弱。低多样性导致的特异性功能的丢失可能会导致一定程度上的土壤养分代谢减弱，从而增加生物竞争。总体而言，这时候的装配过程更可能是由当时的环境条件所决定，所以表现为多变的确定性装配过程。
第三部分：酸性、碱性条件土壤中的低多样性群落装配。在土壤pH变的极端的条件下，环境对于微生物群落的选择作用大大增强，从而发生同质选择，使得广义的功能基因表达占主导

通过模型的结果表明，在低多样性的群落中，特异性功能类别的相对丰度降低，而广义性功能类群的相对丰度有所增加。这种情况导致在细菌多样性较低的群落装配中确定性装配过程占主导地位。然而，在高多样性群落中，特异性功能的存在导致了群落的随机性装配过程占优势。

扩展

1．生物测序方法

（1）16S rRNA扩增子测序

扩增子是一段DNA或RNA，是扩增或复事件的来源，通过扩增子的扩增，大量增加某段DNA的含量。微生物扩增子测序中常用的扩增子是16S rRNA基因，其为编码原核生物核糖体小亚基的基因，大小适中，具有9个可变区域和10个保守区域，通过保守区域可以反映物种间的亲缘关系，而可变区域可以体现物种间的差异。在基因的可变区域内，V4区域特异性较好，数据库信息全，因此一般选择V4区域进行扩增子测序（本文即选择V4区域）。

进行扩增子测序的步骤（图7）在于先在特殊引物的作用下通过扩增技术（PCR或LCR），扩增扩增子的数量再进行定量，在实验过程中，也会先将扩增出的大量扩增子进行串联后进行测定，定量方法可以采用RT-PCR以及DNA测序技术（如next-generation sequencing）。

（2）高通量测序

高通量测序也被称作下一代测序或第二代测序，是大规模并行测序方法。其测序步骤一般按照以下过程：首先，通过体外的PCR扩增DNA测序文库；再通过DNA的复制合成进行测序，而非传统的链终止化学过程确定；同时，在空间上DNA以大规模平行的方式同时测定。但是在具体的测定原理上有焦磷酸测序、可逆终止子测序、连接酶介导测序、磷酸连接的荧光核苷酸测序等方法。本文使用的为Illumina MiSeq，采用的为可逆终止子进行测序，下文以此为例对其原理进行介绍。
该方法在包括核苷酸结合、荧光成像和裂解切割的循环中使用可逆的终止子结合dNTP（碱基ATCG的缩写）。即可逆终止子与特定的dNTP结合，当dNTP结合上DNA链，终止子通过终止或抑制基因修饰使得DNA合成在添加单碱基后终止，之后通过终止子结合荧光基团使得添加的单碱基序列，荧光成像后可逆终止子裂解脱落与未结合dNTP结合形成循环（图8）

（3）宏基因组测序

宏基因组测序是微生物研究领域新兴的研究思路，其不包含对某个特定微生物种群的靶向，而是对有所微生物基因组总和进行测定。本文测定微生物功能基因时使用的鸟枪法测序（Shotgun sequencing）即为微生物宏基因组测定的经典方法。其原理在于将基因组打断为数百万个DNA片段，对每一个片段进行测序后通过特定的计算机程序将所有零碎的DNA片段信息整合为整段的DNA序列

2．针对微生物测序的数据分析过程

拿到基因组测序的数据（如16S扩增子测序数据）后我们往往很迷茫，不明白数据如何处理和分析，下文将简单叙述宏基因组数据处理的一般步骤和常用参数。
（1）OTU的构建：OTU为系统发生学、群落遗传学研究中为了方便统计，在一定相似度下给某一分类单元设置的标志，通常按照97%的阈值（相似度）进行区分，相似度小于97%，则可以认为不同种，相似度小于93%-95%则可以认为不同属。OTU的构建是数据分析的基础，通常通过聚类分析给出。
（2）测序深度Coverage：一般在OTU的构建过程中计算机便会给出，是指样品基因文库的覆盖率，数值越高，表示测序样品中序列被测出的概率越高
（3）α多样性的分析（样品内的差异）

菌群丰度的计算——Chao1：是用chao1 算法计算群落中只检测到1次和2次的OTU数估计群落中实际存在的物种数。Chao1 在生态学中常用来估计物种总数，Chao1值越大代表物种总数越多
菌群多样性的计算——香农多样性：反应生物α多样性的大小，Shannon值越大，说明群落多样性越高。
（4）β多样性的分析（样品间的差异）
PCoA分析、PCA分析（主成分分析）：通过对数据的降维，寻找与数据差异最大因素，在横纵坐标上图进行体现
NMDS分析（非度量多维尺度分析）：基于进化关系的样品组之间差异的比较，其通过排序在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本，从而使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息，但是与PCA等方法比摒弃了原始的数据大小，只保留数据顺序信息。

2021年10月13日2021年10月13日

土壤肥力的测定和评价

一、土壤肥力测定的意义及其作用

土壤是化学、生物和物理过程相互作用的复杂系统，为了获得高产的栽培作物，必须很好的平衡这些相互作用。农业的生产力和作物的产量在很大程度上取决于土壤的营养成分和营养状况。因此，通过合适方法了解土壤营养状况是确保作物高产的基础。
通过土壤肥力的测定，一方面，可以了解土壤矿质营养的丰缺程度，以指导农业生产中肥料种类和施用量的确定；另一方面，可以根据测定的土壤物理、化学和生物参数评价土壤状况，选择适宜的种植作物并指导其进行土壤改良。
随着社会的发展进步，土壤测试已经逐渐成为确保作物产量的重要实践。一方面，逐渐发展的机械化导致农业种植的规模逐渐增加，对肥料科学施用的要求愈发强烈；另一方面，合成氨技术的发展，使得作物具有了更高的产量，这导致了大量的作物养分，特别是土壤磷和钾资源的枯竭。因此，土壤肥力的测定对作物生产起到了愈发重要的作用。

二、土壤养分测试的原理和流程

土壤养分的目标是测定土壤中与植物生长息息相关的土壤矿质营养成分或者其他物理化学指标，因此其要求测定指标与作物的生长需求具有一定的相关性。土壤测试的流程包括了：1）确定分析项目 2）田间采样 3）样品处理 4）选择分析方法 5）室内分析。为了确保测定参数的准确性、以及和作物生长的相关性，一方面要求田间采样具有代表性（本文不进行深入讨论）；另一方面要求选定的样品处理方法和测定方法所测定参数能很好反映了作物的生长需求，其中最为重要的则是土壤样品的浸提步骤。
在土壤养分分析的发展历史中，诞生了许许多多测定方法，这些方法大多是采用了不同的浸提剂进行浸提。而在这些方法中，一些与作物生长状况具有良好相关性的方法被广为流传成为了经典方法。下文将从各个项目的测定方法开始，到一些经典方法的介绍，最后对现代的一些土壤分析仪器进行扩展。

三、土壤基本肥力测定

1．有机质的测定

土壤有机质是土壤中各种形态有机化合物的总称，是植物营养元素的重要来源，对土壤的物理化学性质都具有巨大影响。土壤有机质的测定有干烧法、湿烧法、铬酸氧还滴定法和比色法。其中较为广泛使用的为铬酸氧还滴定法，其原理在于通过重铬酸钾氧化有机质,通过亚铁离子在指示剂（邻菲罗啉）下滴定确定重铬酸钾使用量，间接确定有机质含量，根据加热方法不同，又分为外热源法和稀释热法。

2．全氮含量的测定

土壤氮素是植物需要的大量营养元素之一，而植物50%以上的氮来自于土壤。土壤全氮包括了土壤中的无机和有机氮成分。全氮的测定采用干烧法和湿烧法，其中广泛使用的为湿烧法（开式法）。其原理为在催化剂作用下，浓硫酸氧化氮素为铵根离子，通过碱转化为氨被H3BO3吸收后在溴甲酚绿-甲基红指示剂下通过标准酸滴定间接得到全氮含量。

3．全磷含量的测定

土壤全磷测定包含了土壤的有机磷及占大多数的无机磷（磷酸盐为主）。全磷的测定包括样品分解和磷的定量。常用的样品分解方法有碱熔法和酸熔法，一般采取H2SO4-HClO4酸熔法进行样品分解。而磷的定量可采用重量法、滴定法以及比色法，综合各种方法的优缺点，一般采用钼锑抗比色法作为磷定量方法。其原理为通过钼酸与磷产生杂多环，这个杂多环会在还原剂的作用下还原形成兰色-钼兰，在分光光度计下测定。

4．全钾含量测定

土壤全钾的测定包括了土壤矿物结构钾、非交换态钾、交换性态钾和水溶性钾。全钾的测定也包括样品的分解和钾的定量，其中样品的分解多采用HF-HClO4酸溶法进行；而钾的定量普遍采用火焰光度法，在灼烧的状态下通过原子发出的波长光来测量钾的含量。

四、指导施肥的土壤养分测定

1．土壤有效氮的测定

土壤有效氮的测定可以分为可矿化氮的测定、易水解氮的测定和无机氮（硝态氮、亚硝态氮、铵态氮）的测定

（1）土壤可矿化氮测定

可矿化氮的测定采用为微生物对土壤氮进行充分分解矿化，使得易水解有机氮转化为无机氮，通过测定其无机氮含量来计算可矿化氮含量。根据微生物分解矿化的条件，可分为好气培养法和嫌气培养法。

可矿化氮的测定方法	测定条件	优缺点
好气培养法	1）温度：25-35°C 2）水分：50-60%最大持水量 3）时间：2-4周	与N吸收相关性高；条件严格；可靠性较差
嫌气培养法	1）嫌气态 2）温度：30-40°C 3）时间：1-2周	条件易控；快速准确；有反硝化干扰

（2）易水解氮的测定

（3）无机N的测定

硝态氮的测定

硝态氮的定量可采用酚二磺酸与紫外分光光度计的方法，前者通过酚二磺酸在无水条件下与下三反应生成碱性条件下的稳定黄色产物而测定；后者是通过在紫红外波段硝酸根离子的不同吸收特性进行测定。

硝态氮定量方法	条件	干扰	适用范围	优缺点
酚二磺酸法	无水条件；微碱性或保持中性	Cl-、NO2-、重金属、有机质	0.1-2 mg L-1	准确性高；操作繁琐
紫外分光光度法	OH-、CO32-、HCO3-、NO2-、及Fe3+、Cu2+、有机质	快速便捷；准确性较高

亚硝态氮测定

亚硝态氮的测定最常用的为Griess比色法（重氮-偶联法），其原理为亚硝酸根与重氮试剂发生重氮化反应，然后与偶合试剂发生偶合形成红色偶氮化产物而测定

铵态氮测定

铵态氮的测定普遍采用靛酚蓝比色法进行，其通过铵态氮与次磷酸盐和苯酚的作用生成靛酚蓝得以显色，通过测定兰色测定铵态氮量。

2．土壤有效磷测定

3．有效钾的测定

4．Cu、Mn、Zn、Fe的测定

Cu、Mn、Zn、Fe为属于土壤微量元素，其测定与土壤大量元素存在一定差异。由于其在土壤中含量较低且组成复杂，因此往往要求测定过程中不得引入外界离子干扰，且对定量方法的灵敏度具有较高的要求

5．土壤S的测定

6．土壤B的测定

土壤有效B常常使用沸水浸提（水土比2:1，沸腾5min），定量方法常常通过甲亚胺分光光度计进行测定，其原理为甲亚胺与H3BO3形成黄色络合物，在分光光度计下进行测量。

7．土壤Mo的测定

土壤Mo的浸提可以使用沸水直接浸提，但其与植物的相关性较差，一般使用草酸-草酸铵（pH3.3）进行浸提。而其定量可以采用极谱法或者硫氰酸盐分光光度法进行定量。后者是在酸性介质中，硫氰酸盐与Mo6+络合，经过还原得到橙黄色络合物，可以进行比色定量。

8．土壤Cl的测定

土壤Cl测定方法	测定条件	评价
莫尔法	滴定溶液的pH6.5-10.5
Hg(NO3)2滴定法	pH 3.0-3.5	终点明显；试剂有毒
氯电极法	-	终点不明显；简便快速
硫氰酸汞比色法	-	-

9．土壤Ca、Mg测定

土壤Ca、Mg的测定一般采用EDTA配合滴定法，在pH12下以钙红作为指示剂EDTA滴定测定Ca含量，再在pH10条件下以铬黑T作为指示剂测定Ca、Mg合量，通过差值计算得到Mg含量。

10．土壤其他重金属的测定

对于重金属离子的浸提，一条思路是使用螯合剂或者酸对土壤的重金属离子进行螯合和浸提；另一条思路则是通过吸附金属吸附重金属离子后进行测定。对于重金属元素的测定，往往是使用联合浸提剂浸提多种重金属元素后通过AAS或者ICP等仪器手段进行测定。

五、土壤物理参数的测定

1．土壤pH的测定

土壤pH表征了土壤酸度大小，是衡量土壤质量的一个重要指标。常用的pH测定方法有比色法与电位法，其中比色法由于精度较低，常常用于野外的土壤速测，而电位法则是根据指示电极和参比电极之间的电池反应产生的电位差计算pH值的大小，具有准确快速的特点。在测定pH时需遵守以下标准：（1）水土比2.5:1或5:1 （2）浸提剂1mol/L KCl（酸性土）或0.01mol/L CaCl2溶液（中性碱性土）（3）浸提用水为去离子水（4）浸提时间30min （5）粒径1-2mm

2．阳离子交换量的测定

阳离子交换量的测定的基本原理是通过浸提剂交换胶体上的可交换离子，再将游离离子洗去后交换下胶体上的离子进行测定，这便对浸提剂的选择提出了较高的要求。一方面要求浸提剂能够完全交换胶体上的阳离子；另一方面浸提剂的交换离子需要便于测定。而根据测定土壤的酸碱性不同，浸提剂的选择往往也有所不同

（1）酸性中性土壤

往往选择pH 1mol/L的NH4OAc作为浸提剂，由于其具有干扰少，NH4+定量方法多等优点，使得其被广泛使用

（2）石灰性土壤

石灰性土壤含有较多的碳酸钙、碳酸镁，在浸提过程中会参与阳离子交换，因此一般选择pH8.2的缓冲体系以减少其溶解。

浸提剂选择	适用条件
1 mol/L NaOAc（pH 8.2）	含MgCO3多的土壤
BaCl2-三乙醇胺（TEA）（pH 8.2）	含CaCO3多的土壤
NaOAc-NaCl法	含石膏多的土壤
(NH4)2C2O4-NH4Cl快速法	-

六、现代土壤测定仪器

七、土壤测定项目的选择——以顺义农田为例

1．顺义土壤背景状况

根据中国土壤数据库数据可知，顺义土壤为灰黄土，质地多为砂质粘壤土，干旱缺水，pH8.0-8.5，微碱性反应。耕层有机质0.95-1.3%；全氮0.065-0.088%；全磷0.1-0.22%，速效磷7-16ppm；全钾2.0%，速效钾120ppm；Zn 0.95ppm；Cu 2.58ppm；B 0.125ppm；Fe 19ppm ；Mn 13ppm。且顺义区为北京的工业强区，可能存在重金属超标的问题。

2．测定指标与方法

八、土壤养分评价指标体系

土壤测试由于其自身的特点，不同方法对土壤养分的测定不同，且不同作物对土壤养分的需求不同，这就导致了土壤测试很难形成（或者说不可能）一个普适的评价标准。最为精确的评价标准一定是对应于特定的测量方法（下表以俄勒冈州立大学的土壤测试标准为例）；在综合考虑多种测量标准的前提下，可以给出较为粗略的评价标准（下表以第二次土壤普查的土壤分级为例）。

因为土壤标准的难以统一，科学家们便转而开始寻找衡量土壤养分状况的综合指标。根据土壤各项养分的含量我们已经可以给出该项指标的评价，而却无法综合多项指标给出足够信服的综合指标。在这里给出作者猜想的土壤综合评价的思路：首先，通过选定的各项指标标准，为各项指标进行评价打分，在对各项指标进行归一化处理后，先待定土壤各项指标间的权重，计算拟合综合指标与作物产量等性状的相关度，求得相关度最高情况下各指标的相对权重，以此作为土壤综合评价指标的标准。
而在一般情况选，往往采取土壤养分的几个重要值指标（如有机质、全氮、有效氮、有效磷、钾）等作为综合指标的参考。一个例子便是北京市对于土壤养分的等级划分规则，其中选取了有机质、全氮、碱解氮、有效磷和速效钾作为综合指标的衡量参数（这里不做介绍）。基于这种思路，有研究也提出了综合多项养分指标评价土壤养分情况的综合指标QUEFTS。

参考文献

1、Janssen B.H., Guiking F.C.T., van der Eijk D., et al. A system for quantitative evaluation of the fertility of tropical soils (QUEFTS). 1990, 46(4):299-318.

2、D.A. Horneck, D.M. Sullivan, J.S. Owen, and J.M. Hart.Soil Test Interpretation Guide.2011，Affiliation: Oregon Cooperative Extension，EC1478.

3、E.S. Marx, J. Hart, and R.G. Stevens.Soil TestInterpretation Guide.1999，Affiliation: Oregon Cooperative Extension，EC1478.

4、R.L. Westerman.Soil Testing and Plant Analysis, Volume 3, Third Edition.1990，the Soil Science Society of America.

5、Dhotare, V. A., Guldekar, V. D., Bhoyar, S. M., & Ingle, S. N. (2019). Evaluation of Soil Nutrient Index and their Relation with Soil Chemical Properties of Washim Road Farm of Dr.PDKV Akola, Maharashtra, India. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 8(09), 1773-1779. doi:10.20546/ijcmas.2019.809.205

6、中国土壤数据库-顺义：http://vdb3.soil.csdb.cn/front/detail-%E6%95%B4%E5%90%88%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%BA%93$integ_cou_soiltype?id=40175

7、R. A. Viscarra Rossel and A. B. McBratney.Soil chemical analytical accuracy and costs: implications from precision agriculture.1998，Australian Journal of Experimental Agriculture 38(7) 765 - 775

写在最后

写完了，呼~可喜可贺。
我写完了，假期也过完了呢（黑化）。
你说学习它还爱我吗？

2021年10月13日2022年4月28日

植物根系切片性状的测定

上接植物根系测定平台，这一次讲一讲我在测玉米根系性质的时候，如何观察根系切片性状

简介

Root Scan是一个java构建的对于根系横切面进行半自动图像分析的软件。其可以根系根系横切面图像的20多个性状，并自动划分气孔、皮层等结构。Root scan结果作为期刊发布于Plant and Soil. Volume 357, Numbers 1-2, 189-203 (2012)。具体下载方式请谷歌搜索宾夕法尼亚州立大学（penn state）Root Scan。

操作过程

以下图为例进行，
在file目录下选择load image导入图片。点击start，程序自动识别图片轮廓

点击approve outline提取轮廓图片，点击process描绘全图轮廓

点击start phase two和approve outline显示标注中柱结构

在cortex下点击start three 和approve aerenchyma对皮层部分进行细胞识别和标注

最后点击finish，返回自动测定的横切面数据

测定项目

RXSA = Cross section area
TCA = Cortex area
TSA = Stele area
RatioCtoS = Cortex:Stele ratio
RatioCtoXS = Cortex:Cross Section ratio
RatioStoXS = Stele:Cross Section ratio
AA = Aerenchyma area
percCisA = Percentage of cortex that is aerenchyma
nonAA = Total cortex area - AA
MXVA = Metaxylem vessel area
percSisMX = Percentage of stele that is metaxylem
percXSisMX = Percentage of cross section that is metaxylem
MX_mean = Mean metaxylem size
MX_median = Median metaxylem size
MX_min = Minimum metaxylem size
MX_max = Maximum metaxylem size
MX_num = Number of metaxylem vessels
CF_num = Number of cell files
CCA = Cortex cell area
percCisCC = Percentage of cortex that is cortical cells
percXSisCC = Percentage of cross section that is cortical cells
CC_mean = Mean cortical cell size
CC_median = Median cortical cell size
CC_num = Number of cortical cells
Z0andEpi_mean = Mean of all cells in zone zero and the epidermis
Z0_mean = Mean of all cells in zone zero (edge)
Z1_mean = Mean of all cells in zone one (middle)
Z2_mean = Mean of all cells in zone two (center)
Z0andEpi_median = Median of all cells in zone zero and the epidermis
Z0_median = Median of all cells in zone zero (edge)
Z1_median = Median of all cells in zone one (middle)
Z2_median = Median of all cells in zone two (center)
Z0andEpi_num = Number of all cells in zone zero and the epidermis
Z0_num = Number of all cells in zone zero (edge)
Z1_num = Number of all cells in zone one (middle)
Z2_num = Number of all cells in zone two (center)
LA_mean = Mean lacunae size
LA_median = Median lacunae size
LA_min = Minimum lacunae size
LA_max = Maximum lacunae size
LA_num = Number of lacunae
Files start counting from 0 at the epidermis
Ratings indicate image quality, 0 the worst, 10 the best

实验室使用

在实验室中对植物根系横切面进行观察，可以配置一解剖镜，一显微镜，显微镜上附转化头将图片直接传输到计算机的rootscan上来实现快速、大批量的植物根系横切面观察。通过与之前的DIRT平台，可以快速对大批量的植物根系性状进行测定。

2021年10月12日2022年4月28日

植物根系性状的测定

简介

Digital Imaging of Root Traits（DIRT）是一个使用DIRT成像协议计算70多种表型特征的计算机平台，其主要思路是通过计算机处理根系图片给出表型特征，这种方法作为2014年10月的Plant Physiology的封面，其软件平台2015年11月上线PlantMethods。
具体的测定表型特征可见官方入门手册

操作步骤

首先打开网址

选择右上角register或login，需要提供iplant账号。
在上方ROOT下有create root image collection，点击进行创建图片集，然后在图片集中进行上传（upload）

然后勾选分析的图像，同时可以点击Calibrate Threshold对图像进行校准，校正完成后会返回图像共目视检验

下面是最主要的一步

RSA Trait Computation

首先点击COMPUTATIONS菜单下的CREATE
COMPUTATION创建计算

然后可在COMPUTATIONS菜单下的My查看计算结果
自动生成csv文件，可进行下载

导出的数据见下方

setwd("C:/Users/Administrator/Desktop")
> library(readxl)
> shuju<-read_xlsx("root.xlsx",sheet = 2)
> shuju
# A tibble: 1,241 x 9
   IMAGE_ID IMAGE_NAME   AREA AVG_DENSITY WIDTH_MED WIDTH_MAX RTP_COUNT ANG_TOP ANG_BTM
      <dbl> <chr>       <dbl>       <dbl>     <dbl>     <dbl>     <dbl>   <dbl>   <dbl>
 1   750867 1-1.jpg    17359        12.0      140.      176.        284    67.6    51.4
 2   750868 1-2.jpg    21682.       11.0      154.      175         376    66.7    48.2
 3   750869 1-3.jpg    22450.       12.0      140.      164.        348    67.6    46.3
 4   750870 2-1.jpg     8121.        8.16      84.3     107.        278    52.5    36.4
 5   750871 2-2.jpg     7346.        4.74      69.4      85.0       213    46.2    29.6
 6   750872 2-3.jpg     7737.        4.06      76.0     107.        312    48.6    32.3
 7   750873 3-1.jpg    13176.        4.52     112.      129.        527    64.0    42.9
 8   750874 3-2.jpg    13344.        6.92     119.      139.        480    62.8    44.4
 9   750875 3-3.jpg    15414.        6.34     108.      121.        422    61.8    40.4
10   750876 5-1.jpg    12223.       11.8      143.      171.        571    67.9    51.5
# ... with 1,231 more rows

2021年10月12日2022年8月20日

搞玉米搞玉米

不同玉米品种根际水解酶的原位研究

写在最前面

这个科研项目是我大二时的urp项目，得到了导师和郝师兄的许多帮助（感谢师兄该我的学术垃圾），基于作者只是一个快乐科研的本科生，如有错误，请您~~友好地~~指正。

一、研究目的

根际（rhizosphere）指受根系活动影响的土壤区域，是重要的土壤微生物活性热区，由根系释放释放根系分泌物和其他根际沉积物形成 (Kuzyakov & Blagodatskaya, 2015)。这些根际沉积物可以激活微生物，增加胞外酶合成分泌，导致根际区域的生物化学进程十分剧烈。根际范围可以影响的范围从根表延申到土体土壤，取决于不同土壤养分状况、根系形态结构和根系分泌物的质量和数量酶活性根际热区可以延申到1-3mm (Kuzyakov & Razavi, 2019; Ma et al., 2018; Tian, Razavi, Zhang, Wang, & Blagodatskaya, 2020)。根际区域是植物与土壤交换能量和养分的关键区域，且可以通过调节生物化学反应的强度和范围，以应对外界环境变化。土壤酶是土壤生物化学进程的关键，因此关于植物根际区域酶活性和热区范围的研究具有十分重要意义。
传统的荧光微孔板酶活性检测方法只能通过检测单点的酶活性，而无法真实反应原位土壤酶活性，难以精确区分根际酶活性和非根际酶活性。且该方法在检测过程中，需将土壤制成土壤匀浆，所检测的酶活性包含前期微生物（作物根系）分泌的残留酶，这部分酶被土壤掩蔽，在自然条件下不会显示活性，因而无法区分所测的酶活性是由微生物（植物）对底物添加的响应还是固定在土壤中微生物前期分泌的残留酶活性(Nannipieri et al., 2012)
新兴的酶谱技术可以实现酶活性原位二维显示(Razavi, Zarebanadkouki, Blagodatskaya, & Kuzyakov, 2016)，该方法可以测定酶活性在根际的原位分布，已有研究表明不同的根系构型、不同品种、有机肥添加、养分差异和重金属污染以及不同酶之间的根际酶活性热区范围存在显著差异(Ge et al., 2017; Liu et al., 2017; Ma et al., 2019; Wei et al., 2018)
玉米是我国的重要作物，在粮食、能源等方面具有重要的作用，氮肥的投入是玉米持续高产的主要原因(Guo et al., 2010)。随着工业氮肥合成技术推广以来，化学氮肥投入已达到一百年前氮输入的10倍(Canfield, Glazer, & Falkowski, 2010)。过量的N肥投入不仅会导致N肥利用率降低，还会造成环境问题。因此通过育种培育氮高效玉米品种，提高氮肥利用效率对玉米高产稳产，环境保护至关重要。我国在玉米育种方面具有长达数十年的经验，培育出了许多高产高效的玉米品种，而关于高效玉米品种根系如何挖掘土壤养分的是我们所不知的，此研究选取两种玉米品种（郑单958、先玉335），通过酶谱法测定比较两种品种玉米的根际水解酶分布状况。此研究是根际氮高效玉米养分高效吸收的根际-土壤-微生物互作体系研究的一部分，以揭示氮高效玉米根际酶分布如何支持玉米养分利用的高效性，并进一步为根际-土壤-微生物体系的研究提供支持。

二、材料和方法

1.试验设计

选取郑单958与先玉335两个品种，其都为常见的氮高效玉米品种。土壤使用来自农民传统施肥方式的土壤，将土壤过2mm筛后混匀，分为两组，一组不做处理，一组加入氮肥，可以认为本实验存在高氮土壤和不施氮的低氮土壤两个水平。实验共设置两因子、两水平共4个处理，其中每个处理设置3个重复。（图1）

2.播种管理

选取24cm*30cm的根盒，有机玻璃板上附聚酰胺膜，加入事先处理的土壤至根盒重1.2kg，玉米种子经过双氧水消毒后，放置于饱和硫酸钙中浸泡6h后置于湿润滤纸上一个晚上。种植前浇水湿润土壤，将种子放入土壤1cm深，再放入人工气候室中倾斜45°（使得根系与聚酰胺膜玻璃面接触）进行培养。土壤换水率为田间持水量的60%，培养期间通过称重法补水。（图1）

3.酶谱测定

酶谱测定选取与碳代谢有关的酶为纤维素酶（BG）；与氮代谢有关酶为α-N-乙酰氨基葡糖苷酶（NAG）；与磷代谢有关酶为磷酸酶（AP），其对应底物见表1。培养至20天后进行酶谱分析，拍摄根际酶谱图后根据酶谱图取出根际土与非根际土进行酶活性测定。

类别	酶	底物
与碳代谢有关	纤维素酶（BG）	4-MUF-β-D-xylopyranoside
与氮代谢有关	α-N-乙酰氨基葡糖苷酶（NAG）	4-MUF-β-D-glucopyranoside
与磷代谢有关	磷酸酶（AP）	4-MUF-β-D-Phosphate
与氨基酸代谢有关	亮氨酸氨基肽酶（LAP）	L-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin

表1：酶谱分析各种酶对应底物(German et al., 2011)

三、实验结果

1.根盒玻璃板肉眼观察

二十天后观察根盒玻璃板面，观察可见两组施肥处理根系密度远大于未施肥处理，且先玉335（XY335）品种根系密度大于郑单958（ZD958）品种（图2 ）

2.根际酶谱图像

对聚酰胺膜进行拍摄得到的图片（图3），可见施氮处理增加了根际水解酶的活性和范围。且先玉品种较郑丹品种具有更好的根际酶活性与范围，先玉品种更加适应低氮胁迫。
图3是师兄的图，就不放了hhhh

3.酶谱图像灰度值、热区半径分组分析

通过图像处理软件image J (V6.2.4)将像素转化为256位的灰度模式（其中红色灰度为255，对应最高酶活性；蓝色灰度为0，对应最低酶活性），在此基础上减去聚酰胺膜的背景灰度值得到酶谱图数据。观察根际的灰度值在112以上分布，这里人为选取112、128、160作为阈值，通过将各组酶谱图的灰度值将酶活性范围分为酶活性热区（160-255）、中等热区（128-160）、低热区（112-128）三组，得出对应的各组平均灰度与范围半径。
关于NAG酶，所选的三个阈值范围内，处理表现为类似的趋势，均表现为先玉低氮灰度值最高，郑单高氮灰度值最低，且呈现出显著差异。在低氮和高氮条件下，尽管未表现出显著性，可以观察到先玉品种的平均灰度值均高于郑单品种（图4B）。根际热区范围方面，在不同的灰度值阈值区域，高氮条件下的根际热区范围均高于低氮条件，说明低氮条件下的根系活动拓宽了酶活性的范围。另一方面，在低氮条件下，可以观察到郑单品种在给定阈值范围内的热区范围显著大于先玉品种，说明在低氮条件下，郑单品种具有更大的热区范围（图4A）。通过分析可得，郑单与先玉品种在低氮条件下都会通过根系活动增加NAG酶的活性和范围，但同时两个品种的侧重点有所不同，具体表现在先玉品种在酶活性方面更有优势；而郑丹品种更侧重于酶活范围。

LAP酶在所选择的三个阈值范围内，并未呈现出明显显著性差异。在热区半径方面，112-128、128-160的灰度阈值区域呈现出相似趋势，即低氮条件下郑丹品种LAP热区半径较小；而高氮条件下先玉品种LAP酶热区半径较大（图5A）。在灰度值128以上的区域内，高氮与低氮条件下，先玉品种都呈现出更大的热区范围，说明先玉品种可能具备比郑单品种更大的根际区域（图5B）。

在所选择的三个灰度阈值范围内，各处理并未表现出显著性差异，但不同处理呈现出相似趋势，即高氮条件下郑丹根际BG酶活性高于先玉，而在低氮条件下则低于先玉（图6B）。在热区范围方面，高氮条件下，郑单表现出更大的根际热区范围，而在低氮条件下并未表现出显著性（图6A）。

三、讨论

酶是参与土壤有机质降解和土壤养分循环的关键(R. L. Sinsabaugh et al., 2008)，随着农业绿色可持续发展观念的兴起，土壤酶指标逐渐被纳入土壤健康的评价指标之一(Cao, Sun, Yang, Sun, & Zhao, 2003)。
此研究中我们发现了玉米品种在根际热区范围与酶活性方面的差异，面对低氮胁迫，先玉335通过增加酶活性，而郑丹通过增加酶热区范围。这种差异体现了玉米品种面对养分胁迫的不同选择策略。增加酶活性可以提高对土壤有机质的矿化程度，增加活性养分供应，而酶活性热区范围的增加，可以在保证确定根系大小的情况下增加养分吸收区域。以往的研究重点主要是酶活性高低，对酶活性热区范围的研究不够。
植物如何通过调节根际酶活性与范围间的平衡是我们所不知的。在一项水稻的根际酶谱研究中便引入了生态学的r对策与k对策的概念加以解释(Wei et al., 2018)，快速发展的r对策微生物偏爱于利用简单底物，而k对策微生物更适宜于难降解的底物（如纤维素、木质素）。植物根系具有分泌碳源的能力，刺激根系周围r对策微生物的生长，加速对酶的合成(Spohn & Kuzyakov, 2013)，土壤根源碳的含量会随着与根表的距离增加而迅速降低，导致k对策微生物的数量增加，有研究报道在土壤与根系距离增加的情况下，发现了k对策微生物（放线菌）的数量增加(Kawasaki A, 2016)，这说明植物可能是通过根系碳源的释放，对根际微生物群落进行调整，进而改变了酶活性与酶活性范围。
酶谱法是近几年新兴的原位酶活性表征技术，分析的结果会受到许多因素的影响，其中底物向土壤的扩散以及成像步骤常常会影响实验结果的准确性。
在背景校正方面，因为聚酰胺膜上其他物质对于光的发射可能会影响酶谱图的拍摄，因此我们使用空白的聚酰胺膜进行背景校正，而事实上许多土壤中的许多有机化合物可以扩散入聚酰胺膜，在紫外光下呈现出荧光（如腐殖质和其他一些重金属元素(Nobuo Watanabe, 2004)），这是本实验所欠缺考虑的。
酶在根系的活性范围扩张受到两个关键过程的影响，分别是酶生产者（主要是微生物）的定殖和活性(Kuzyakov & Blagodatskaya, 2015)，以及酶和底物的扩散，其中后者受到碳和养分利用效率的调节(Robert L. Sinsabaugh et al., 2014; Zhu et al., 2018)，因此根系酶活性区域的大小在一定程度可能与植物养分利用效率密切相关。在此基础上，我们通过灰度值人为划定的热区范围能否在一定程度上表示根际酶活性区域是一个值得研究的命题。

五、小结

通过土壤酶谱技术使我们能够可视化地研究玉米根际酶活性及其分布，两种玉米品种均可以通过增加酶活性与酶热区范围来适应低氮条件，而两者在面对养分胁迫的不同选择策略存在差异，先玉品种侧重于增加酶活性，促进有机物矿化，而郑丹品种偏向于增加酶活区域来扩大植物养分吸收的范围。基于此实验结论，我们猜测先玉与郑丹品种根际酶活性与范围的差异通过植物根系碳源的分泌加以调控。因此，对植物根际酶活性及其范围的进一步研究是必要的，以挖掘氮高效玉米品种的根际作用机理及其调控机制。

六、参考文献

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写在最后

本实验就存在许多问题和不严谨的地方，其中最最致命的是在灰度阈值范围的选取上，其实关于这方面的文献内容很少，这个阈值范围就是随意确认的。不过这是我大二时的科研训练项目，之后就对分子生物和基因组学感兴趣了，结题之后就没有继续修改了。

先康康tassel啥样

先介绍目录框

【file】

【data】

【impute】

【filter】

【analysis】

导入数据

数据质控

观察表型数据

计算协变量

整合数据

进行gwas分析

结果可视化

写在最后

一、实验材料

二、原理

三、实验步骤

1．种子的消毒灭菌

2. 幼苗的平板培养

3．GUS组织化学染色及显微镜观察

结果

1.拟南芥平板观察

2．染色烟草显微镜下观察

讨论

参考文献

写在最前面

摘要

一、全球气候变化背景

二、植物干旱胁迫记忆

三、干旱胁迫记忆机理

1.胁迫记忆信号的积累

2．表观遗传的变化

3.其他机理

四、干旱胁迫记忆的意义

五、胁迫记忆的应用

1.利用MSH1基因选育雄性不育材料

2.增强植物适应能力

3.指导农业生产

参考文献

写在最前面

摘要

一、传递细胞

二、NPF7.6亚细胞定位和编码蛋白功能揭示

1．组织定位

（1）GUS染色

（2）GFP亚细胞定位

（3）编码蛋白功能验证

三、NPF7.6基因功能确认

1．NPF7.6突变体的构建

2．NPF7.6突变体表型性状差异

四、NPF7.6调控机制的揭示

五、讨论

六、参考文献

引言

数据提取

异常值的剔除与各组数据集中程度的衡量

数据异常值的剔除

正态性检验

单因素方差分析

多重比较

这里写写摘要

实验背景

论文思路和方法

论文思路

实验方法

1.土壤选取和实验处理

2.DNA提取和测序

3.数据分析

实验结果

1．重新组装细菌群落的系统分类特征

2．细菌群落的装配过程

3．重新装配细菌群落的潜在的功能

4．细菌群落装配过程的概念模型

扩展

1．生物测序方法

（1）16S rRNA扩增子测序

（2）高通量测序

（3）宏基因组测序

2．针对微生物测序的数据分析过程