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PCR引物设计

喜闻乐见碎碎念

今天又帮对门兄弟提了一天RNA，我一不看着他就做错好几步，分明是来帮实验的倒是变成教实验的。不禁感慨，和你做实验像坐牢（笑死）
这个兄弟后续会测定RNA浓度、qPCR，趁着在实验室“坐牢”，就问了问怎么设计引物，抱着该死的好奇心，我花了一晚上整明白了（芜湖）

引物设计要求

搬运自其它博主

  • 长度15-30bp
  • CG含量40-60%
  • 引物模板序列Tm 72℃最佳，至少55-80℃
  • 3'端引物一般不使用A
  • 避免3'端出现3个碱基重复
  • 等等

引物设计软件

Primer Premier 6
请自行下载（去微信搜搜或许是个好方法）

分析步骤

1.下载基因序列数据

通过NCBI下载基因数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI主页

在搜索框输入对应基因名称检索基因序列数据，这里我们使用Arabidopsis thaliana NRT1.1 基因，其为拟南芥中硝酸盐转运蛋白基因，下载序列。

通过Primer Premier设计引物

  • 打开Primer Premier 6 软件
    Primer Premier 6界面

  • 在file-open-sequence打开下载的基因序列，打开效果如上图

  • 选择 analyze-primer search

  • 在弹出的设置页选择primer parameters对参数进行设置

  • 1.其中Tm为熔融温度

  • 2.Ta 为退火温度（应该）

  • 3.amplicon lenght 为产物长度

  • 4.alternate primer pairs为可替换碱基对
    其中最重要的为熔融温度

  • 点击serch返回检索得到的引物序列，默认显示best 的引物序列

    其中会显示引物的rating和引物的具体信息，包括引物序列、位置、长度、Tm值等信息。在右上的序列图上会显示扩增序列序列位置

  • 右击引物序列选择all primers返回可选择的引物序列列表及其信息，点击all structure可以显示其结构，根据需要选择合适的引物序列点击replace选择替换

引物序列验证

选择的引物序列需要进行验证

  • 在NCBI主页上选择blast后选择primer-blast
  • 在use my own foraward primer框后输入先引物序列，其序列可以右键引物后选择copy sense primer复制
  • use my own reverse primer框输入后引物序列，其可以右键copy anti-sense primer复制
  • 在organism输入需要扩增的物种名称
  • 点击get blast获取报告
    -读取报告

    primer-blast选择只有一个基因NRT1.1与引物序列匹配，特异性挺好，就他了。

完毕

接下来把序列交给公司就搞定了

芜湖，好奇心满足了

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提取培养细胞RNA

写在前面

作为一位热心市民，今天去帮对门好兄弟做了个提取培养细胞RNA的实验。虽然对于大部分同学来说，这个实验很简单来着，但是我得写一写以免一天摸鱼无所事事（狗头）。

实验设计

对门好兄弟的实验是观察到根系一类菌在某一节点具有两种代谢途径，便打算通过测定两种代谢途径下游的RNA的表达，来从经济角度考虑其生存策略。在处理后在不同时间段采样以分析RNA表达随处理时间的变化，其包含近30个测定指标（RNA），通过qPCR对表达量进行定量。

RNA提取试剂盒

使用的试剂盒为TIANGEN的RNA提取试剂盒，主要成分如下：

  • 裂解液RL（Buffer RL）：主要功能为裂解细胞
  • 去蛋白液RW1（Buffer RW1）：主要功能为洗去蛋白质
  • 漂洗液RW（Buffer RW）：用于漂洗（这不是没说？）
  • 无RNA酶双蒸水（RNase-Free ddH2O）
  • RNase-Free吸附柱CR3（RNase-Free Columns CRS set）
  • RNase-Free过滤柱（RNase-Free Columns Cs set）
  • RNase-Free DNase I：DNA 的消化液
  • RDD缓冲液：DNA消化缓冲液
  • RNase-Free离心管

所有试剂盒提取RNA 的原理大同小异，都是通过裂解液裂解细胞后通过过滤柱，在乙醇下DNA、RNA固定与吸附柱，再进行漂洗、去掉蛋白等过程；之后加入DNase去掉DNA得到RNA。

注意事项

最重要的就是预防RNase的感染，不然哦，白忙活哦！

  • 建议带个口罩操作哈
  • 多换手套
  • 别省那点枪头哈
  • 使用RNase-Free的水，别乱加就行

实验步骤

  • 取出细菌样品，在室温下融化
  • 在细菌中提前加入β-巯基乙醇；
  • 轻弹离心管底部（经验步骤），加入350ul RL Buffer（一般细菌量不多就加这么多）
  • 旋震荡10s，室温培养10min，其中每2min旋涡10s
  • 所有溶液转运至过滤柱CS上，12000rpm下离心2min
  • 向滤液加入350ul（经验数值） 70%乙醇，混匀后转移入吸附柱CR3，12000rpm下离心2min后倒掉滤液
  • 向吸附柱加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min后倒掉滤液
  • 配置DNase工作液，DNase I与RDD缓冲液体积比为1:7；根据要进行的个数配置工作液（一般可以配置所需溶液的1.2倍）
  • 向吸附柱中央（尽量滴到中央哦）加入80ul DNase工作液，室温放置15min
  • 向吸附柱中加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm下离心2min，弃去滤液
  • 向吸附柱加入500ul漂洗液RW（RW实现加入酒精）后室温静置2min，12000rpm下离心2min后弃去滤液。这个过程重复2次
  • 12000rpm下再离心2min后弃去滤液，打开离心管盖室温放置数分钟以除去残余漂洗液以免对RT等测定产生影响
  • 将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管，加入60ul（选择范围30-100ul，推荐分两次加入）RNase-Free ddH2O后室温放置2min，12000rpm下离心2min，滤液即为RNA
  • 如果要对RNA保存，请于-70℃环境保存

哦，这该死的好奇心

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基于GUS报告NtNRT1.2启动子的活性鉴定

一、实验材料

  • NtNRT1.2 Promoter::GUS的转基因烟草（根系）。实验使用的预测性启动子为NtNRT1.2基因编码的起始密码子上游2000bpDNA片段。

    二、原理

    GUS染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性，并进行化学定位的一种方法。GUS（β-glucuronidase）是一种报告基因，其来源于大肠杆菌，编码β-葡聚糖苷酶，这种酶可以催化底物5-溴-4-氯-3吲哚葡聚糖醛酸苷（X-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，以观察特定基因的表达。
    通过在我们所研究基因的启动子后接上GUS基因，当我们所研究的基因表达，GUS基因也会随着表达，将植株通过X-Gluc进行染色后可显现深兰色，以此来显示特定基因的表达位置（图1）
    图1：Repoter Gene 的作用机理

    三、实验步骤

    1．种子的消毒灭菌

    1. 将种子置于1.5mL离心管，加入70%乙醇表面消毒1-2分钟
    2. 移去酒精，加入Bleach溶液（2%次氯酸钠+0.1%SDS），吹打几下后，浸泡15-20分钟
    3. 在超净台中移去Bleach，使用无菌水清洗5遍以上，清洗时移液枪头插至离心管底，缓慢吸取液体
    4. 清洗后的种子放置于培养皿内灭菌的滤纸上，晾干备用

2. 幼苗的平板培养

  1. 将置于滤纸上的拟南芥种子经过表面喷洒酒精消毒置于超净台中
  2. 双手进入超净台进行操作前佩戴橡胶手套，同时对双手、手臂以及所以放入超净台的物品（培养基、移液枪等）进行酒精喷洒消毒
  3. 待双手及所有物品上酒精蒸发后，点燃酒精灯，打开培养基，将镊子置于酒精灯火焰上灼烧至略红
  4. 将镊子拿离火焰，稍稍冷却后夹取牙签，用手拿取镊子夹住的一头
  5. 用牙签先微微沾取少量培养基，将滤纸上种子沾至牙签，点至培养基
  6. 点约20-25个种子，每个种子距约1cm
  7. 点种完毕后上覆盖子，用封口膜密封
  8. 4℃冰箱进行处理1-2天后于拟南芥培养室培养培养（21-22℃、光照16h/黑暗8h、关照强度80-120 微mol/(m-2s-1)），竖直放置待种子生长8-10天

注意事项

  • 1.种子消毒时候应当进行吹打，使得消毒充分
  • 2.吸取与液体时应当移液管枪头插入离心管底部，再缓慢吸取液体
  • 3.所有物品包括双手、手臂进入超净台之前务必使用酒精消毒，避免污染
  • 4.在超净台内点燃酒精灯前要确认超净台所有物品及双手上无肉眼可见酒精
  • 5.超净台内镊子竖直放置
  • 6.牙签拿取部位应该是镊子的夹取部位以保证另一端的无菌
    MS培养基配方

3．GUS组织化学染色及显微镜观察

  1. 配置GUS染色液（共1mL）
  2. 将待处理的幼苗从培养基上取下放入染色液
  3. 于37℃培养箱黑暗处理12h以上
  4. 将染色好的幼苗置于70%酒精中脱色后于显微镜下观察
    GUS染色液配方

结果

1.拟南芥平板观察

其实最开始进行染色的是拟南芥，后来拟南芥染不上色，就用了染好的烟草来观察。
经过平板培养的拟南芥已生长出叶和较长的根，由于培养时候整个培养基竖直摆放，拟南芥根在培养基表匍匐生长，便于取出

图1.平板培养拟南芥图片

2．染色烟草显微镜下观察

在肉眼下观察染色烟草根系，发现染色区域多集中于整根，侧根区域染色较少，且成熟的上部根系染色较为明显，而较为幼嫩的下部根系染色程度较低，甚至不染色（图2a），因此我们猜测，NtNRT1.2多在根系成熟成熟区域表达，由于根系成熟区域主要执行养分吸收功能，因此我们猜测NtNRT1.2应该与植物根系成熟区的氮吸收有关。
接下来我们将烟草根系置于低倍显微镜下进行观察，我们发现根系的中柱部分显示出大范围的染色，表面NtNRT1.2在中柱区域大量表达，而侧根原基区域并为显示出明显染色（图2b）；进一步在高倍镜下观察侧根，发现侧根没有显示出明显染色。
图2.染色烟草显微镜观察：a：肉眼观察烟草根系；b：低倍显微镜观察烟草根系（示侧根原基）；c：高倍镜下观察烟草根系（示中柱和顶端分生组织）
在观察的同时，我们发现在侧根的根尖出现了略微染色（图3a），观察其他烟草根系，并未发现侧根根尖染色的情况，在此植株的其他侧根上也较少发现类似现象，这一小概率现象还待进一步考证。同时我们观察到一个有趣的现象，在侧根与主根中柱的汇集处，染色程度较深，这可能是由于中柱较为集中导致的（图3b），但是我们也大胆的猜测，中柱的汇集处可能存在分配养分运输的机制，因此需要更多转运蛋白协调物质的中柱养分分配，因此与氮素营养运输有关的NtNRT1.2表达量增加
图3：a.根尖染色的侧根；b.主根与侧根中柱汇集区域的染色状况
综上所述，烟草根系染色在主根区域较为明显，且较为成熟的区域颜色程度较高，染色的具体区域为中柱，因此，我们猜测NtNRT1.2定位于植物根系成熟区域的中柱，参与植物根系的氮的长距离运输。

讨论

正经人谁猜啊，我直接打开UniProt直接搜索NtNRT1.2蛋白，还真搜到了。

提交名称NRT1.2，由烟草（Common tobacco）NtNRT1.2-s基因表达，定位于膜，参与硝酸盐的跨膜运输，铵态氮的系吸收。也有证据表明其可能参与磷酸根离子和寡肽的运输。
进一步，我们又发现一篇刊于《frontiers in Plant Science》2018; 9: 210的文献，看了看这篇文献的作者，我一瞬间明白了我们可爱的刘老师为啥让我们做NtNRT1.2的GUS染色(Liu et al., 2018)。
通过不同的氮处理下，间隔一段时间测定烟草根系和叶片中的NtNRT1.2的表达，可以发现NtNRT1.2对于氮具有一定的反应，特别是硝态氮，随着硝态氮的输入，NtNRT1.2在一段时间后显著表达，且这种表达会受到氮缺乏的抑制（图4），因此不难猜测NtNRT1.2应当参与了植物根系硝酸盐反应
图4.NtNRT1/2不同氮处理的响应：紫色为根系，蓝色为叶片(Liu et al., 2018)
对植物根系一天内不同时间段内的NtNRT1/2的基因表达的测定表明NtNTR1.2在6:00与8:00达到表达高峰（图5），考虑到植物在夜间需要进行活跃的碳水化合物同化，此过程需要大量的氮素提供，因此这暗示我们NtNRT1.2应当与氮的吸收和运输相关
图5.一天内不同时间根系的NtNRT1/2基因表达(Liu et al., 2018)
更进一步，通过在拟南芥nrt1.1-1突变体内转入NtNRT1.1与NtNRT1.2 的基因来验证其基因功能。半定量RT-PCR证明了NtNRT1.1/1.2在拟南芥中的表达，通过拟南芥叶片和根系鲜重的测定（图6），证明了NtNRT1.1/1.2显著提高突变体生长状况，间接证明了NtNRT1.2参与植物根系硝酸盐的吸收。
图6.拟南芥突变体内表达NtNRT1.1/1.2可显著改善其在硝酸盐上的生长状况(Liu et al., 2018)

参考文献

Liu, L. H., Fan, T. F., Shi, D. X., Li, C. J., He, M. J., Chen, Y. Y., . . . Sun, Y. C. (2018). Coding-Sequence Identification and Transcriptional Profiling of Nine AMTs and Four NRTs From Tobacco Revealed Their Differential Regulation by Developmental Stages, Nitrogen Nutrition, and Photoperiod. Front Plant Sci, 9, 210. doi:10.3389/fpls.2018.00210

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[文献阅读]传递细胞介导硝酸盐吸收以控制根瘤共生

写在最前面

最近考试超多的好嘛，卷起来了，但又没完全卷。今天看了篇分子生物学的文章，觉得还挺有趣的，按自己的思路便写写看。文章为2020年的nature plants，题为Transfer cells mediate nitrate uptake to control root nodule symbiosis（具体见参考文献文献）
这篇论文我劝你耗子尾汁，不要让我看不懂

摘要

根瘤共生为植物提供了固氮的能力，从而提高作物产量。环境硝酸盐水平影响着根系结瘤和固氮，但是豆科植物调节硝酸盐吸收以调节根瘤共生的机制仍不清楚。通过鉴定苜蓿NPF家族的一个成员NPF7.6，观察到NPF7.6在根瘤维管组织中特异性表达，且定位于根瘤转移细胞的质膜上，在那里NPF7.6起到高亲和硝酸盐转运体的作用。进一步通过构建NPF7.6的突变体，使得突变体在根瘤维管组织发育异常，且表现出硝酸盐吸收减少、一氧化氮稳态紊乱和固氮酶活性减弱，基于此提出了NPF7.6参与根瘤调控的机制。(Wang et al., 2020)

一、传递细胞

传递细胞是一类特殊的薄壁细胞，在植物中一般位于维管组织内（图1a），起到转运营养物质的作用；其具有内折的质膜，形成许多指状不规则凸起以增大表面积（图1b），根瘤内的传递细胞也被称为NTCs
图1.植物传递细胞：a.植物维管组织的结构（示彻底细胞）；b.传递细胞的示意图（示向内凸起的质膜）

二、NPF7.6亚细胞定位和编码蛋白功能揭示

1．组织定位
（1）GUS染色

GUS 染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性，进行化学定位的一种方法。GUS（β-glucuronidase）是一种报告基因，其来源于大肠杆菌，编码β-葡聚糖苷酶，这种酶可以催化底物 5-溴-4-氯-3 吲哚葡聚糖醛酸苷（X-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，以观察特定基因的表达。通过在我们所研究基因的启动子（promoter）后接上 GUS 基因，当我们所研究的基因表达，其启动子被激活，GUS 基因也会随之表达，将植株通过 X-Gluc 进行染色后可显现深兰色，以此来显示特定基因的表达位置（图2）。
图2：报告基因进行细胞定位的原理

通过克隆NPF7.6的启动子并接上GUS基因构建pNPF7.6::GUS构建体，通过X-Gluc染色后可以观察到NPF7.6基因在根瘤维管组织内特异性表达（图3），植物基因的功能往往与基因的表达位置具有密切的关系，因此，这暗示我们NPF
7.6很可能与硝酸盐的运输有关。
图3.GUS染色：a.根瘤肉眼观察；b.根瘤切片的GUS染色图片（示维管组织的染色状况）

（2）GFP亚细胞定位

GFP与GUS基因类似，都为报告基因，通过在苜蓿根的NPF7.6启动子后加入GFP基因，构建NPF7.6启动子驱动的NPF7.6::GFP构建体，GFP基因表达的蛋白可以显示出绿色荧光来显示基因的表达位置。
与GFP处理的对照组相比，BPF7.6::GFP的荧光定位于质膜（图4a），特别是在传递细胞向内凸起的细胞膜处（图4b），带有更亮的斑点，这表明NPF7.6定位于质膜部位，特别是细胞膜向内凸出的部位。通过三维重建荧光定位位置进一步揭示NTCs向内凸起细胞膜上的NFP7.6空间分布模式（图4c-d），我们可以观察到，NPF7.6很可能在根瘤共生期间在根瘤传递细胞上吸收硝酸盐，特别是传递细胞向内凸起的质膜上。
图4.GFP亚细胞定位：a-b.GFP荧光（示传递细胞向内凸起的质膜）；c-d.3D重构的GFP荧光定位模式（示向内凸起的质膜）

（3）编码蛋白功能验证

为了验证NPF7.6编码蛋白的作用，这里通过在卵母细胞中注射NPF7.6的cRNA进行评估，同时选取了高亲和的CHL1进行对比。在0.2和10mM的硝酸盐浓度下，NPF7.6的转运能力均低于CHL1，但是与对照组进行比较，NPF7.6表现出显著的硝酸盐转运能力（图5a）。进一步对NPF7.6进行动力学分析表明，对于硝酸盐的吸收，NPF7.6表现出具有饱和点的饱和动力学方式。因此，我们可以确定，NPF7.6编码高亲和的质膜定位的硝酸盐转运体。
与此同时，我们发现了NPF7.6的活性可以通过植物根瘤的定殖以及外界硝酸盐的浓度变化（图5c），这暗示我们NPF7.6很可能参与根瘤对于外界硝酸盐浓度的感应并调控根瘤的生长发育。
图5.NPF7.6编码蛋白的功能验证：a.在0.2、10mM硝酸盐浓度下，卵母细胞的硝酸盐吸收；b.NPF7.6的动力学方程；c.根瘤定殖和外界硝酸盐浓度下的NPF7.6基因表达量

三、NPF7.6基因功能确认

1．NPF7.6突变体的构建

为了获得NPF7.6在根瘤共生中的作用，我们使用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除NPF7.6得到两个突变体（npf7.6-1、npf7.6-2），他们在NPF7.6基因第一个的第一个外显子区域存在突变。
图6：CRISPR-Cas9基因编辑位点

2．NPF7.6突变体表型性状差异

将得到的NPF7.6突变体与野生型（R108）在不同硝酸盐浓度下培养以观察野生型与突变体对于外界硝酸盐的浓度。在表型上，NPF7.6突变体在高氮条件下表现为根结较短，而在低氮条件下表现为更大的根结，且保留高氮条件下的粉色表型（图7a）。进一步对根瘤的鲜重、根瘤长度和根瘤数目进行测定，数据表明NPF7.6的突变体与野生型相比在鲜重和根瘤长度方面变化的范围缩小（图7b-d），这表明NPF7.6的缺失导致了植物根系对于外界硝酸盐浓度的反应迟缓
图7.NPF7.6突变体的表型差异：a.不同硝酸盐浓度下突变体与野生型的表型差异；b.鲜重差异；c.根瘤长度差异；d.根瘤数目差异

进一步，我们根瘤进行横切以观察突变体在维管组织发育上的不同。对根瘤切片的扫描电镜显示，NPF7.6突变体的根瘤维管组织与对照组相比更为分散而显示为一种异常的维管组织发育模式（图8A-B）。我们已经指出了NPF7.6定位于传递细胞质膜，传递细胞最为特殊的为向内凸起的质膜，因此我们通过扫描电镜观察了突变体的传递细胞内突部位，并通过3D重建野生型和突变体的传递细胞内突结构。对照组R108中的传递细胞具有复杂结构的质膜内突，并伴有线粒体和广泛的内质网；与野生型光滑的内突相比，突变体内突表面呈现出夸张的锯齿状（图8C-D）。
这些证据表明，定位于传递细胞质膜的NPF7.6很可能通过调控硝酸盐的吸收来调控根瘤维管组织的表型可塑性。
图8.根瘤横切的扫描隧道显微镜图片：A-B.根瘤横切的扫描隧道显微镜图片（示维管组织各个区域）；C-D.3D重建的传递细胞内突结构

四、NPF7.6调控机制的揭示

为揭示NPF7.6在根瘤共生中的调节机制，我们先对根瘤硝酸盐吸收进行探索。我们通过向根瘤表面添加N15标记的硝酸盐来模拟根瘤吸收外界硝酸盐的过程；同时向距根瘤2cm的根部区域添加N15标记的硝酸盐模拟根瘤从根系中吸收硝酸盐的过程，在添加硝酸盐2h后收集并测定根瘤中的N15含量。结果显示，缺失NPF7.6功能的突变体缺失了从根系中吸收硝酸盐的能力，同时从外界环境吸收硝酸盐的能力也有显著降低（图9a-b）。这些证据同时也证明了根瘤从外界和宿主根部吸收和运输硝酸盐需要NPF7.6。
基于NPF7.6对于根系吸收硝酸盐的功能，我们提出以下可能的机制：在无氮条件下，根瘤诱导NPF7.6的表达，使得根瘤可以从宿主根系中吸收硝酸盐以维持自身生长；低氮条件下，NPF7.6被大量表达，促进根系对于外界硝酸盐的吸收以缓解根瘤与宿主根系对于硝酸盐的竞争；而在高氮条件下，过量表达的NPF7.6使得胞内硝酸盐浓度升高而抑制了根瘤的生长（图9c）
图9：a.根瘤从外界吸收硝酸盐；b.根瘤从宿主根系吸收硝酸盐；c.NPF7.6调控根瘤生长的可能机理

NPF7.6在高氮条件下对于根瘤生长的抑制机理并未清楚，我们尝试从转录组方面选择可能的机理。通过转录组的分析我们发现了一类Lb蛋白的表达变化，这类蛋白是根瘤中最为丰富的蛋白质，具有维持NO稳态，保持硝酸盐活性的作用，以此为线索，我们发现了参与编码Lbs的11个基因中发生了9个基因的显著下调（图10a）；为了进一步确定Lbs的下调是否导致了NO的变化，我们通过DAF-2-DA方法进行了NO的染色，实验表明NO在突变体中表现为广泛的累积（图10b），NO荧光强度显著提高（图10c）。而NO的积累会显著降低固氮酶的活性，从而抑制了根瘤的生长。另外，胞外实验已经表明，高浓度的硝酸盐具有显著抑制Lb基因表达的作用
图10：a.野生型与突变体中Lbs基因的表达；b.DAF-2-DA染色NO；c.染色荧光强度
基于以上的证据，我们提出如下的高氮调控机制：在高氮条件下，过量表达的NPF7.6导致对于硝酸盐的过量吸收，从而导致胞内硝酸盐浓度的大量累积。高浓度的硝酸盐抑制了Lbs基因的表达，间接导致了NO的积累，从而抑制固氮酶的活性，根瘤的生长因此受到抑制（图11）
图11：高氮条件下NPF7.6的调控机制

五、讨论

在拟南芥中，鉴定出两个硝酸盐转运家族NRT1、NRT2，前者更名为NPF家族。NPF家族的功能已经过大量的研究，在如uniprot在线平台可以检索其家族蛋白质的功能。对于NPF家族的功能研究，主要有以下方面：NPF在结节形成、结节器官发生中起核心作用；是表皮细胞中诱导皮层细胞分裂导致结节原基形成所必需的(Rival et al., 2012)；NPF参与结瘤前识别根瘤菌的第一步(Amor B.B., 2003)；NPF在根瘤与苜蓿根瘤菌共生期间需要通过触发感染线并将细菌释放到发育中的根瘤感染区的细胞质中(Moling et al., 2014)。
在拟南芥、水稻、玉米等作物中发现了大量的NPF家族基因，它们在硝酸盐吸收上都发挥着类似功能，这也为我们提供了研究基因功能的思路，先寻找同源基因的功能并基于此猜测和验证基因功能。

六、参考文献

Amor B.B., S. S. L., Oldroyd G.E.D., Maillet F., Penmetsa R.V., Cook D., Long S.R., Denarie J., Gough C. (2003). The NFP locus of Medicago truncatula controls an early step of Nod factor signal transduction upstream of a rapid calcium flux and root hair deformation. the plant journal, 34(4), 495-506.

Moling, S., Pietraszewska-Bogiel, A., Postma, M., Fedorova, E., Hink, M. A., Limpens, E., . . . Bisseling, T. (2014). Nod factor receptors form heteromeric complexes and are essential for intracellular infection in medicago nodules. Plant Cell, 26(10), 4188-4199. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25351493. doi:10.1105/tpc.114.129502

Rival, P., de Billy, F., Bono, J. J., Gough, C., Rosenberg, C., & Bensmihen, S. (2012). Epidermal and cortical roles of NFP and DMI3 in coordinating early steps of nodulation in Medicago truncatula. Development, 139(18), 3383-3391. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22874912. doi:10.1242/dev.081620

Wang, Q., Huang, Y., Ren, Z., Zhang, X., Ren, J., Su, J., . . . Kong, Z. (2020). Transfer cells mediate nitrate uptake to control root nodule symbiosis. Nat Plants, 6(7), 800-808. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32514144. doi:10.1038/s41477-020-0683-6