这里写写摘要
本文通过梯度稀释法产生了不同微生物多样性的细菌群落，并通过测序研究生物多样性与群落装配、群落功能的影响，并推测其潜在的功能性状。通过系统发育零模型分析，表明了随机装配在高多样性群落中的主导地位；低多样性群落中确定性装配的主导地位，同时这种确定性装配导致了特定功能的丢失，从而限制了群落功能。
实验背景
由于土壤微生物复杂以及难以培养的特性，使得对微生物多样性与生态功能的研究十分困难，自Whittaker提出生物多样性的概念后，为土壤微生物的研究提供了全新的研究思路。随着不断的研究，越来越多的证据已经指出，微生物的α多样性（即样本群落内的生物多样性）对生态系统的功能具有重要作用，而对于β多样性（即多个样本群落间的生物多样性）的影响关注较少，事实上β多样性对于推断土壤生物的群落装配过程是随机性还是确定性的具有重要意义。
微生物群落是陆地生态系统的重要组成部分，微生物的活动极大地影响了生态系统的功能及其稳定性。在生态学上，具有一个普遍的假设，即包含众多物种的生态系统具有高度的稳定性和生态系统功能，基于此提出物种功能的重叠为生态系统的稳定性提供了一些冗余与缓存，但是即便如此，我们对于和多样性有关的细菌群落如何相互作用调节生态系统功能和群落装配所知甚少。
在自然条件下，微生物群落的生长受到各种因素的影响，根据研究指出，土壤微生物多样性受到pH、土壤类型、纬度、植被、湿度、温度和养分的强烈影响，其中pH值是土壤多样性和丰度最佳的预测指标。一般来说，我们将土壤微生物多样性和功能的产生称为群落装配过程，其过程反映了群落组成的时空聚集过程，可以分为确定性和随机性过程。
基于已有的研究，本研究从微生物多样性出发，通过改变土壤微生物的多样性，分析其群落结构的组成和丰度差异（α多样性），进而观察生物多样性的不同对生态系统功能的影响；同时通过不同生物多样性的微生物群落结果的比较（β多样性）尝试分析土壤微生物的装配过程。
论文思路和方法
论文思路
通过将不同稀释浓度的土壤浸出液接种到灭菌处理的不同pH培养基，人为制造土壤微生物生物多样性的差异，培养16周后进行测序。先通过香农多样性（衡量α多样性的一种参数）观察不同处理的多样性差异；之后在影响微生物多样性的因素中选取具有代表性的pH、土壤类型、养分因素，进行变异分析，寻找导致多样性差异的主要因素。再通过|βNTI|（衡量β多样性的一种参数）比较不同处理间的差异，进而分析其群落装配过程是否为随机性装配过程。最后分析与生态系统功能有关的各类基因的表达差异，尝试分析微生物生物多样性的不同是否导致了生态系统功能的不同。即文章以以下思路展开：人为稀释显著降低生物多样性；生物多样性的降低触发了群落的确定性装配；群落的确定性装配会在一定程度上影响微生物群落的生态系统功能
实验方法
1.土壤选取和实验处理
移取土壤稀释液所用的土壤分别为黑土与红壤，按照土壤分类，其分别为钙质黑钙土、铁铝始成土（具体原始土壤土壤参数见下表1）。两种土壤一部分经过2mm筛后与室温下维持于恒定水分（田持30%），另一部分通过γ射线消毒。无菌土壤进行预实验，确定调节pH所需的CaO、FeSO4量。通过20g新鲜土样与180ml无菌水得到10-1稀释浓度，根据10-1稀释浓度稀释液得到10-4、10-7、10-10稀释梯度（图1），同时通过CaO、FeSO4获得pH梯度4.5、5.5、6.5、7.5、8.5（具体使用量见下表2）。共252个水平，其中5个pH处理×4个稀释处理×2个土壤类型+2个初始土壤处理，每个土壤处理6个重复。于20℃、45%田持条件下培养，每两周测定pH与Ca、Fe、SO4浓度，共培养16周。
表1：实验用原始土壤的土壤参数
| 土壤类型 | pH | 有机质% | N mg/kg | P mg/kg | K mg/kg |
|---|---|---|---|---|---|
| 黑土 | 8.0 | 4.6 | 100.8 | 16.7 | 90.5 |
| 红壤 | 5.3 | 1.6 | 53.9 | 0.95 | 61.5 |
2.DNA提取和测序
培养16周后进行DNA提取，采用提取试剂盒，每个处理取两个重复，即三个重复提取DNA进行混合以最大限度减少误差。先在分光光度计260/280nm与260/230nm波长下评估提取DNA的质量。将通过评估的提取DNA在引物作用下进行PCR扩增，采用的16S rRNA扩增技术，对扩增细菌的16S rRNA V4高变区域进行扩展测序。测序数据进行质控后以97%的相似性进行聚类形成OTU以便后续分析；而其基因功能通过比对基因数据库进行基因功能注释。
3.数据分析
基于测序得到的OTU表，通过计算机程序得到香农多样性与NMDS分析；综合测定的pH、Ca、Fe、SO4浓度可以进行VPA（方差分解分析）得到土壤类型、pH、Ca、Fe、SO4浓度对于细菌群落变化的贡献。不同处理的比较（β多样性的比较）通过Unifrac方法进行（使用邓肯方法进行显著性比较），但为了推断群落的装配过程，引入参数βNTI，其中|βNTI|<2表明所观察到的系统发育组成的差异是随机过程的结果。基因功能的比较采用构建相对丰度的热图，数据来源于红壤的宏基因组测序，其中相对丰度指的是隶属于该功能组的序列数除以每个样本的总序列数，其结果以热图显示。
实验结果
1．重新组装细菌群落的系统分类特征
稀释对于重新装配细菌群落的组成具有显著的影响（图2a、b），同时pH对群落的组成也具有一定影响，在基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度(NMDS)中，不同稀释浓度的土壤群落在横坐标上分离，而不同pH的土壤群落在纵坐标上分离（图2a），表明稀释与pH对土壤微生物群落的重新装配具有最为显著的影响。将pH与稀释浓度作为横纵坐标的香农分析得出，香农多样性随着稀释浓度的增加而降低；而pH上，香农多样性在pH为中性的条件下处于较高水平（图2b）。
对不同pH下的黑土与红壤进行加权的UniFrac群落相异度分类分析得出两种土壤都在不同稀释浓度下表现出较大差异，且随着稀释浓度的增大，差异也随之增大（图3a）；以土壤类型进行比较得出不同土壤类型在不同稀释浓度上也存在着较大差异（图3b）。到此说明了虽然稀释的影响细菌群落结果的最大因素，但是pH与土壤类型对其也具有一定的影响。
通过变异分解分析（VPA）对土壤类型、pH与Ca、Fe、SO4浓度对于群落结构差异的相对贡献进行评价（图3c-h）。随着稀释浓度的增大，土壤类型的贡献逐渐降低；而pH的影响逐渐增大；Ca、Fe、SO4浓度的影响较小，可以忽略。
2．细菌群落的装配过程
为了辨别随着稀释浓度与pH梯度变化，群落中的确定性与随机性变化，引入参数βNTI。通过|βNTI|与稀释梯度与pH梯度的关系（图4a-d），可以得到，群落装配过程随着稀释梯度水平的增加，逐渐从随机性过程(|βNTI|>2)向确定性过程（|βNTI|<2）转变，并且中性条件（pH6.5）下其向多变性的确定性装配过程转变（即|βNTI|>2,
系统发育周转率高于预期）；其他pH条件下向均一化的确定性装配过程转变（|βNTI|<2，系统发育周转率低于预期）。将香农多样性与|βNTI|进行相关性分析，得到两者呈现负相关，即微生物多样性低的情况下，土壤微生物趋向于确定性装配过程。
3．重新装配细菌群落的潜在的功能
为了评估各处理的生态功能，对红壤样品提取通过鸟枪法进行宏基因组测序，选取与生态系统有关的一些基因，测定其相对表达丰度。在选定的基因内，一部分基因分布在特定的微生物，如与“硫代谢”“氮代谢”等有关的“特异性功能基因”，我们暂且将其称为FunGP1,。这类基因大部分随着稀释梯度的增加而显著降低；而另一类具有广义功能定义（如“TCA循环”、“糖酵解”有基因）的基因（暂且称为FunGP2）随着稀释梯度的增加，其相对表达量显著升高。（图5a）。尽管FunGp1和FunGp2的相对丰度存在这些相反的模式，各功能类群的多样性随稀释程度的增加呈下降趋势（图4b），且相较于FunGp2(图4c),FunGp1(图4b)的功能多样性下降幅度更大。
为了进一步研究细菌多样性的影响以及确定性或随机性装配过程对代谢功能的相对丰度(FG RA）与多样性（FG Div）的影响，通过计算|βNTI |及其对应的香农多样性指数、FG RA与FG Div之间的相关性(图5d)。发现FunGp1的功能性状多样性和相对丰度、FunGp2的功能性状多样性与Shannon多样性呈正相关，与|βNTI |值呈负相关；而FunGp2的功能性状相对丰度则与Shannon多样性呈负相关，与|βNTI |值呈正相关。
4．细菌群落装配过程的概念模型
综上所述，我们可以看到，随着认为的制造稀释梯度与pH梯度，使得土壤微生物多样性随着稀释梯度的增加而降低，这种微生物多样性的降低使得土壤微生物在重新装配的过程中去趋向于确定性装配过程。而观察这个过程中的基因变化，我们可以发现，随着确定性的装配过程（即低水平的微生物多样性），具有广义功能定义的基因相对表达升高，而具有特异性功能定义的基因相对表达下降，这种结果可能会在一定程度上限制土壤微生物的生态系统功能。
基于这个研究，提出了细菌群落装配过程的概念模型（图6），其解释了与微生物多样性相关的确定性或随机性装配过程如何在不同pH条件下促进细菌群落的结构和功能的装配。
第一部分:高多样性的群落装配。在高生物多样性的阶段内，土壤中含有大量复杂且无法被大多数微生物利用的底物，当环境中的营养物质不足以支持大量微生物时，竞争加剧，而包含“硫代谢”、“氮代谢”等特异性功能的微生物群落，对于分解土壤养分，维持土壤养分循环而潜在地削弱生物竞争起到了重要作用。
第二部分：pH中性土壤中低生物多样性群落装配。在中性环境中大部分微生物都可以生存，这便导致了栖息地对于微生物的选择作用减弱。低多样性导致的特异性功能的丢失可能会导致一定程度上的土壤养分代谢减弱，从而增加生物竞争。总体而言，这时候的装配过程更可能是由当时的环境条件所决定，所以表现为多变的确定性装配过程。
第三部分：酸性、碱性条件土壤中的低多样性群落装配。在土壤pH变的极端的条件下，环境对于微生物群落的选择作用大大增强，从而发生同质选择，使得广义的功能基因表达占主导
通过模型的结果表明，在低多样性的群落中，特异性功能类别的相对丰度降低，而广义性功能类群的相对丰度有所增加。这种情况导致在细菌多样性较低的群落装配中确定性装配过程占主导地位。然而，在高多样性群落中，特异性功能的存在导致了群落的随机性装配过程占优势。
扩展
1．生物测序方法
（1）16S rRNA扩增子测序
扩增子是一段DNA或RNA，是扩增或复事件的来源，通过扩增子的扩增，大量增加某段DNA的含量。微生物扩增子测序中常用的扩增子是16S rRNA基因，其为编码原核生物核糖体小亚基的基因，大小适中，具有9个可变区域和10个保守区域，通过保守区域可以反映物种间的亲缘关系，而可变区域可以体现物种间的差异。在基因的可变区域内，V4区域特异性较好，数据库信息全，因此一般选择V4区域进行扩增子测序（本文即选择V4区域）。
进行扩增子测序的步骤（图7）在于先在特殊引物的作用下通过扩增技术（PCR或LCR），扩增扩增子的数量再进行定量，在实验过程中，也会先将扩增出的大量扩增子进行串联后进行测定，定量方法可以采用RT-PCR以及DNA测序技术（如next-generation sequencing）。
（2）高通量测序
高通量测序也被称作下一代测序或第二代测序，是大规模并行测序方法。其测序步骤一般按照以下过程：首先，通过体外的PCR扩增DNA测序文库；再通过DNA的复制合成进行测序，而非传统的链终止化学过程确定；同时，在空间上DNA以大规模平行的方式同时测定。但是在具体的测定原理上有焦磷酸测序、可逆终止子测序、连接酶介导测序、磷酸连接的荧光核苷酸测序等方法。本文使用的为Illumina MiSeq，采用的为可逆终止子进行测序，下文以此为例对其原理进行介绍。
该方法在包括核苷酸结合、荧光成像和裂解切割的循环中使用可逆的终止子结合dNTP（碱基ATCG的缩写）。即可逆终止子与特定的dNTP结合，当dNTP结合上DNA链，终止子通过终止或抑制基因修饰使得DNA合成在添加单碱基后终止，之后通过终止子结合荧光基团使得添加的单碱基序列，荧光成像后可逆终止子裂解脱落与未结合dNTP结合形成循环（图8）
（3）宏基因组测序
宏基因组测序是微生物研究领域新兴的研究思路，其不包含对某个特定微生物种群的靶向，而是对有所微生物基因组总和进行测定。本文测定微生物功能基因时使用的鸟枪法测序（Shotgun sequencing）即为微生物宏基因组测定的经典方法。其原理在于将基因组打断为数百万个DNA片段，对每一个片段进行测序后通过特定的计算机程序将所有零碎的DNA片段信息整合为整段的DNA序列
2．针对微生物测序的数据分析过程
拿到基因组测序的数据（如16S扩增子测序数据）后我们往往很迷茫，不明白数据如何处理和分析，下文将简单叙述宏基因组数据处理的一般步骤和常用参数。
（1）OTU的构建：OTU为系统发生学、群落遗传学研究中为了方便统计，在一定相似度下给某一分类单元设置的标志，通常按照97%的阈值（相似度）进行区分，相似度小于97%，则可以认为不同种，相似度小于93%-95%则可以认为不同属。OTU的构建是数据分析的基础，通常通过聚类分析给出。
（2）测序深度Coverage：一般在OTU的构建过程中计算机便会给出，是指样品基因文库的覆盖率，数值越高，表示测序样品中序列被测出的概率越高
（3）α多样性的分析（样品内的差异）
- 菌群丰度的计算——Chao1：是用chao1 算法计算群落中只检测到1次和2次的OTU数估计群落中实际存在的物种数。Chao1 在生态学中常用来估计物种总数，Chao1值越大代表物种总数越多
- 菌群多样性的计算——香农多样性：反应生物α多样性的大小，Shannon值越大，说明群落多样性越高。
（4）β多样性的分析（样品间的差异） - PCoA分析、PCA分析（主成分分析）：通过对数据的降维，寻找与数据差异最大因素，在横纵坐标上图进行体现
- NMDS分析（非度量多维尺度分析）：基于进化关系的样品组之间差异的比较，其通过排序在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本，从而使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息，但是与PCA等方法比摒弃了原始的数据大小，只保留数据顺序信息。
