系统发生树的绘制

写在前面

今天写一写聚类图的绘制,因为作者这是个对生信感兴趣的非生物学本科生;再加上我一直认为像我这种靠兴趣学习的小白,从分析过程入手进行学习会有趣些,所以这次内容可能会偏向于操作,具体的原理可以看看其他大佬的。

系统发生数数据的获取

系统发生数的构建主要是基于SNP进行,其具有距离矩阵法、最大似然法、最大简约法和贝叶斯法,其中距离矩阵法中的邻接法为一种常见的方法(各方法具体的原理可见其他大佬的推文,或者等我学完来写写)。
为了省时又便于理解,我们通过tassel5进行获取数据

  • 将SNP数据导入tassel5软件
  • analysis-relatedness-creat tree 进行构建系统发生树
  • 在返回的文件上选择results-archaeopteryx tree可以康一康构建出来的树
    tassel5 create tree

但是,这图明显不好看啊,和我在文章里面看的完全不一样啊

系统发生树数据的导出

在analysis-relatedness-creat tree结果文件导出为newwick格式

系统发生树的美化

方式一:通过iTOL平台

网址如下:https://itol.embl.de/
是这个样子的
自己玩泥巴去吧(自己摸索摸索,很简单来着)

方式二:通过R package-ggtree

ggtree 是Guangchuang Yu(人称Y叔)构建的系统发生树构建的R package,这是ggtree的主页https://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/ggtree/inst/doc/ggtree.html

1、安装package-ggtree
#the first way
install.packages("ggtree")
#一般情况下rstudio默认的源里面是找不到ggtree
#因此可以通过BiocManager下载
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("ggtree")

下载完成后library()一下看一下安装完成否

2、读取.new数据
library(stringr)
library(ggtree)
library(treeio)
tree<-read.tree("tree.nwk")
ggtree(tree,branch.length = 'none',layout = 'circular')+
  geom_tiplab(size=1)

可以看到ggtree的绘制格式类似于ggplot2

3、具体参数介绍
#颜色大小类型等设置类似于ggplot2
ggtree(tree, color="firebrick", size=2, linetype="dotted")
#发生树默认以阶梯状排列,可以自行控制
ggtree(tree, ladderize=FALSE)
系统发生树的类型可以自定义
ggtree(tree, layout="roundrect")
ggtree(tree, layout="slanted")
ggtree(tree, layout="ellipse")
ggtree(tree, layout="circular")
ggtree(tree, layout="fan", open.angle=120)
ggtree(tree, layout="equal_angle")
ggtree(tree, layout="daylight")
ggtree(tree, branch.length='none')
ggtree(tree, layout="ellipse", branch.length="none")
ggtree(tree, branch.length='none', layout='circular')
ggtree(tree, layout="daylight", branch.length = 'none')
#具体效果见下图,更多的效果可以通过设置坐标等进行更改

进化树的组件
#通过geom_treescale()控制
ggtree(tree)+geom_treescale()
#其中参数为
ggtree(tree) + geom_treescale(x=0, y=45, width=1, color='red')
ggtree(tree) + geom_treescale(fontsize=6, linesize=2, offset=1)
#xy控制数的比例位置
#width控制树宽度
#fontsize控制文本大小
#linesize控制线大小
#offset控制文本偏移量
#color控制文本颜色
#通过theme_tree2()添加树的X轴
ggtree(tree) + theme_tree2()
#通过geom_nodepoint()显示内部节点
#通过geom_tippoint()显示外部节点
ggtree(tree) + geom_point(aes(shape=isTip, color=isTip), size=3)

#geom_text()控制显示节点和提示标签
#geom_label()控制显示节点和提示标签
#geom_tiplab()控制显示提示标签
ggtree(tree, layout="circular") + geom_tiplab(aes(angle=angle), color='blue')
#见下图B

#geom_rootedge()控制显示根边
ggtree(tree1) + geom_tiplab() + geom_rootedge()
#通过aes(color=)控制颜色
系统发育树注释
#具体参数如下
Layer   Description
geom_balance    highlights the two direct descendant clades of an internal node
geom_cladelabel annotate a clade with bar and text label
geom_facet  plot associated data in specific panel (facet) and align the plot with the tree
geom_hilight    highlight selected clade with rectanglar or round shape
geom_inset  add insets (subplots) to tree nodes
geom_label2 modified version of geom_label, with subsetting supported
geom_nodepoint  annotate internal nodes with symbolic points
geom_point2 modified version of geom_point, with subsetting supported
geom_range  bar layer to present uncertainty of evolutionary inference
geom_rootpoint  annotate root node with symbolic point
geom_rootedge   add root edge to a tree
geom_segment2   modified version of geom_segment, with subsetting supported
geom_strip  annotate associated taxa with bar and (optional) text label
geom_taxalink   Linking related taxa
geom_text2  modified version of geom_text, with subsetting supported
geom_tiplab layer of tip labels
geom_tippoint   annotate external nodes with symbolic points
geom_tree   tree structure layer, with multiple layout supported
geom_treescale  tree branch scale legend

因内容过多,具体内容可见 Data Integration, Manipulation and Visualization of Phylogenetic Trees,反正我直接偷跑先开始学了~

通过Tassel进行GWAS分析

先康康tassel啥样

tassel5是由康奈尔实验室开发的生物分析软件,在谷歌搜索tassel5进行下载就完事了。
安装完毕,打开tassel界面

先介绍目录框
【file】

主要进行数据的读取,存储

  • open
  • open as
  • save as
    等等

    【data】

    主要进行表格数据的处理

  • intersect join用的地方比较多
    【impute】

    以不同的方法进行填充数据

    【filter】

    进行质控

  • traits:筛选表型列
  • sites:对位点进行筛选
  • taxas:对个体进行筛选
    【analysis】

    分析,gwas操作的主要部分

  • diversity:在多自交系下较少用到,没什么意义
  • relatedness:包括PCA、构建亲缘矩阵、聚类分析等
  • association:gwas的主要部分,包括一般线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)等
导入数据

我们需要以下数据

    1. 表型数据:通过file-open打开
    1. 基因型数据
  • 为plink数据格式,选取open as-plink,选择对应.ped与.map文件
  • 其他数据格式:open as-选取相应格式,一般是用hapmap格式来着,要是软件上找不到对应格式,请反思自己想不开保存的是个啥格式(误)。

    打开后 应该如上图,最上方显示snp位点名称or位置;左侧显示自交系名称,表格内标注snp位点,其中黄色为主要位点,蓝色为次等位点,空白为数据缺失。
    注:tassel好像不怎么对数据进行缺失质控,若需要质控可以通过plink进行质控(见gwas学习笔记)后导入
数据质控

选取snp数据后,在filter-sites打开snp位点质控面板,如下图

其中最为重要的是minimum frequency ,即设置maf质控的阈值,即小于阈值的次等基因进行筛选,点击remove minor snp states会把小于设置阈值的次等基因位点移除。
在filter-filter genotype table taxa 打开个体质控面板

其中min/max heterzygous proportion 控制杂合率,自行设置。
最为重要的质控部分就差不多了,其他质控部分根据需要调整

观察表型数据

选取玉米育种中一个很重要的ss-nss指标作为协变量

表型数据

我们选择表型中的area,ss-nss数据中的ss与ns数据,这个选择通过filter-traits进行

计算协变量

一般可以通过亲缘关系矩阵或pca结果作为协变量加入gwas,这里我们采用亲缘关系矩阵,通过analysis-relatedness-kinship构建

进行gwas 的数据拼图我们拿齐了

整合数据

将两个表现数据表与过滤后的基因型数据合并,通过data-intersect join实现

结果如图

进行gwas分析

选择kinship矩阵和合并后的数据,通过analysis-association-mlm进行分析,因为加入亲缘矩阵,所以用mlm,不加亲缘矩阵就用glm
然后让他跑啊跑完
(跑跑太慢了,我拿其他跑好的数据意思意思一下)
在输出的三个文件中寻找到有p列存在的数据表,一般是第二个文件

结果可视化

在results下选择Manhattan plot 和qq图(最重要的部分),等跑完就可以了


实话实话这个图画的还挺不好看的,可以用r语言画画曼哈顿图,然后标注基因marker

写在最后

把科研学习变成一件快乐的事情,就会快乐许多呢。
祝各位科研快乐~

基于GUS报告NtNRT1.2启动子的活性鉴定

一、实验材料

  • NtNRT1.2 Promoter::GUS的转基因烟草(根系)。实验使用的预测性启动子为NtNRT1.2基因编码的起始密码子上游2000bpDNA片段。

    二、原理

    GUS染色常作为了解特定基因在植物中表达的器官、组织和细胞特异性,并进行化学定位的一种方法。GUS(β-glucuronidase)是一种报告基因,其来源于大肠杆菌,编码β-葡聚糖苷酶,这种酶可以催化底物5-溴-4-氯-3吲哚葡聚糖醛酸苷(X-Gluc)分解,产生肉眼可见的深兰色化合物,以观察特定基因的表达。
    通过在我们所研究基因的启动子后接上GUS基因,当我们所研究的基因表达,GUS基因也会随着表达,将植株通过X-Gluc进行染色后可显现深兰色,以此来显示特定基因的表达位置(图1)
    图1:Repoter Gene 的作用机理

    三、实验步骤

    1.种子的消毒灭菌

    1. 将种子置于1.5mL离心管,加入70%乙醇表面消毒1-2分钟
    2. 移去酒精,加入Bleach溶液(2%次氯酸钠+0.1%SDS),吹打几下后,浸泡15-20分钟
    3. 在超净台中移去Bleach,使用无菌水清洗5遍以上,清洗时移液枪头插至离心管底,缓慢吸取液体
    4. 清洗后的种子放置于培养皿内灭菌的滤纸上,晾干备用

2. 幼苗的平板培养

  1. 将置于滤纸上的拟南芥种子经过表面喷洒酒精消毒置于超净台中
  2. 双手进入超净台进行操作前佩戴橡胶手套,同时对双手、手臂以及所以放入超净台的物品(培养基、移液枪等)进行酒精喷洒消毒
  3. 待双手及所有物品上酒精蒸发后,点燃酒精灯,打开培养基,将镊子置于酒精灯火焰上灼烧至略红
  4. 将镊子拿离火焰,稍稍冷却后夹取牙签,用手拿取镊子夹住的一头
  5. 用牙签先微微沾取少量培养基,将滤纸上种子沾至牙签,点至培养基
  6. 点约20-25个种子,每个种子距约1cm
  7. 点种完毕后上覆盖子,用封口膜密封
  8. 4℃冰箱进行处理1-2天后于拟南芥培养室培养培养(21-22℃、光照16h/黑暗8h、关照强度80-120 微mol/(m-2s-1)),竖直放置待种子生长8-10天

注意事项

  • 1.种子消毒时候应当进行吹打,使得消毒充分
  • 2.吸取与液体时应当移液管枪头插入离心管底部,再缓慢吸取液体
  • 3.所有物品包括双手、手臂进入超净台之前务必使用酒精消毒,避免污染
  • 4.在超净台内点燃酒精灯前要确认超净台所有物品及双手上无肉眼可见酒精
  • 5.超净台内镊子竖直放置
  • 6.牙签拿取部位应该是镊子的夹取部位以保证另一端的无菌
    MS培养基配方

3.GUS组织化学染色及显微镜观察

  1. 配置GUS染色液(共1mL)
  2. 将待处理的幼苗从培养基上取下放入染色液
  3. 于37℃培养箱黑暗处理12h以上
  4. 将染色好的幼苗置于70%酒精中脱色后于显微镜下观察
    GUS染色液配方

结果

1.拟南芥平板观察

其实最开始进行染色的是拟南芥,后来拟南芥染不上色,就用了染好的烟草来观察。
经过平板培养的拟南芥已生长出叶和较长的根,由于培养时候整个培养基竖直摆放,拟南芥根在培养基表匍匐生长,便于取出

图1.平板培养拟南芥图片

2.染色烟草显微镜下观察

在肉眼下观察染色烟草根系,发现染色区域多集中于整根,侧根区域染色较少,且成熟的上部根系染色较为明显,而较为幼嫩的下部根系染色程度较低,甚至不染色(图2a),因此我们猜测,NtNRT1.2多在根系成熟成熟区域表达,由于根系成熟区域主要执行养分吸收功能,因此我们猜测NtNRT1.2应该与植物根系成熟区的氮吸收有关。
接下来我们将烟草根系置于低倍显微镜下进行观察,我们发现根系的中柱部分显示出大范围的染色,表面NtNRT1.2在中柱区域大量表达,而侧根原基区域并为显示出明显染色(图2b);进一步在高倍镜下观察侧根,发现侧根没有显示出明显染色。
图2.染色烟草显微镜观察:a:肉眼观察烟草根系;b:低倍显微镜观察烟草根系(示侧根原基);c:高倍镜下观察烟草根系(示中柱和顶端分生组织)
在观察的同时,我们发现在侧根的根尖出现了略微染色(图3a),观察其他烟草根系,并未发现侧根根尖染色的情况,在此植株的其他侧根上也较少发现类似现象,这一小概率现象还待进一步考证。同时我们观察到一个有趣的现象,在侧根与主根中柱的汇集处,染色程度较深,这可能是由于中柱较为集中导致的(图3b),但是我们也大胆的猜测,中柱的汇集处可能存在分配养分运输的机制,因此需要更多转运蛋白协调物质的中柱养分分配,因此与氮素营养运输有关的NtNRT1.2表达量增加
图3:a.根尖染色的侧根;b.主根与侧根中柱汇集区域的染色状况
综上所述,烟草根系染色在主根区域较为明显,且较为成熟的区域颜色程度较高,染色的具体区域为中柱,因此,我们猜测NtNRT1.2定位于植物根系成熟区域的中柱,参与植物根系的氮的长距离运输。

讨论

正经人谁猜啊,我直接打开UniProt直接搜索NtNRT1.2蛋白,还真搜到了。

提交名称NRT1.2,由烟草(Common tobacco)NtNRT1.2-s基因表达,定位于膜,参与硝酸盐的跨膜运输,铵态氮的系吸收。也有证据表明其可能参与磷酸根离子和寡肽的运输。
进一步,我们又发现一篇刊于《frontiers in Plant Science》2018; 9: 210的文献,看了看这篇文献的作者,我一瞬间明白了我们可爱的刘老师为啥让我们做NtNRT1.2的GUS染色(Liu et al., 2018)。
通过不同的氮处理下,间隔一段时间测定烟草根系和叶片中的NtNRT1.2的表达,可以发现NtNRT1.2对于氮具有一定的反应,特别是硝态氮,随着硝态氮的输入,NtNRT1.2在一段时间后显著表达,且这种表达会受到氮缺乏的抑制(图4),因此不难猜测NtNRT1.2应当参与了植物根系硝酸盐反应
图4.NtNRT1/2不同氮处理的响应:紫色为根系,蓝色为叶片(Liu et al., 2018)
对植物根系一天内不同时间段内的NtNRT1/2的基因表达的测定表明NtNTR1.2在6:00与8:00达到表达高峰(图5),考虑到植物在夜间需要进行活跃的碳水化合物同化,此过程需要大量的氮素提供,因此这暗示我们NtNRT1.2应当与氮的吸收和运输相关
图5.一天内不同时间根系的NtNRT1/2基因表达(Liu et al., 2018)
更进一步,通过在拟南芥nrt1.1-1突变体内转入NtNRT1.1与NtNRT1.2 的基因来验证其基因功能。半定量RT-PCR证明了NtNRT1.1/1.2在拟南芥中的表达,通过拟南芥叶片和根系鲜重的测定(图6),证明了NtNRT1.1/1.2显著提高突变体生长状况,间接证明了NtNRT1.2参与植物根系硝酸盐的吸收。
图6.拟南芥突变体内表达NtNRT1.1/1.2可显著改善其在硝酸盐上的生长状况(Liu et al., 2018)

参考文献

Liu, L. H., Fan, T. F., Shi, D. X., Li, C. J., He, M. J., Chen, Y. Y., . . . Sun, Y. C. (2018). Coding-Sequence Identification and Transcriptional Profiling of Nine AMTs and Four NRTs From Tobacco Revealed Their Differential Regulation by Developmental Stages, Nitrogen Nutrition, and Photoperiod. Front Plant Sci, 9, 210. doi:10.3389/fpls.2018.00210

植物根系切片性状的测定

植物根系切片性状的测定

上接植物根系测定平台,这一次讲一讲我在测玉米根系性质的时候,如何观察根系切片性状

简介

Root Scan是一个java构建的对于根系横切面进行半自动图像分析的软件。其可以根系根系横切面图像的20多个性状,并自动划分气孔、皮层等结构。Root scan结果作为期刊发布于Plant and Soil. Volume 357, Numbers 1-2, 189-203 (2012)。具体下载方式请谷歌搜索宾夕法尼亚州立大学(penn state)Root Scan。
试例

操作过程

以下图为例进行,示例图片
在file目录下选择load image导入图片。点击start,程序自动识别图片轮廓

点击approve outline提取轮廓图片,点击process描绘全图轮廓

点击start phase two和approve outline显示标注中柱结构

在cortex下点击start three 和approve aerenchyma对皮层部分进行细胞识别和标注

最后点击finish,返回自动测定的横切面数据

测定项目

RXSA = Cross section area
TCA = Cortex area
TSA = Stele area
RatioCtoS = Cortex:Stele ratio
RatioCtoXS = Cortex:Cross Section ratio
RatioStoXS = Stele:Cross Section ratio
AA = Aerenchyma area
percCisA = Percentage of cortex that is aerenchyma
nonAA = Total cortex area - AA
MXVA = Metaxylem vessel area
percSisMX = Percentage of stele that is metaxylem
percXSisMX = Percentage of cross section that is metaxylem
MX_mean = Mean metaxylem size
MX_median = Median metaxylem size
MX_min = Minimum metaxylem size
MX_max = Maximum metaxylem size
MX_num = Number of metaxylem vessels
CF_num = Number of cell files
CCA = Cortex cell area
percCisCC = Percentage of cortex that is cortical cells
percXSisCC = Percentage of cross section that is cortical cells
CC_mean = Mean cortical cell size
CC_median = Median cortical cell size
CC_num = Number of cortical cells
Z0andEpi_mean = Mean of all cells in zone zero and the epidermis
Z0_mean = Mean of all cells in zone zero (edge)
Z1_mean = Mean of all cells in zone one (middle)
Z2_mean = Mean of all cells in zone two (center)
Z0andEpi_median = Median of all cells in zone zero and the epidermis
Z0_median = Median of all cells in zone zero (edge)
Z1_median = Median of all cells in zone one (middle)
Z2_median = Median of all cells in zone two (center)
Z0andEpi_num = Number of all cells in zone zero and the epidermis
Z0_num = Number of all cells in zone zero (edge)
Z1_num = Number of all cells in zone one (middle)
Z2_num = Number of all cells in zone two (center)
LA_mean = Mean lacunae size
LA_median = Median lacunae size
LA_min = Minimum lacunae size
LA_max = Maximum lacunae size
LA_num = Number of lacunae
Files start counting from 0 at the epidermis
Ratings indicate image quality, 0 the worst, 10 the best

实验室使用

在实验室中对植物根系横切面进行观察,可以配置一解剖镜,一显微镜,显微镜上附转化头将图片直接传输到计算机的rootscan上来实现快速、大批量的植物根系横切面观察。通过与之前的DIRT平台,可以快速对大批量的植物根系性状进行测定。

植物根系性状的测定

简介

Digital Imaging of Root Traits(DIRT)是一个使用DIRT成像协议计算70多种表型特征的计算机平台,其主要思路是通过计算机处理根系图片给出表型特征,这种方法作为2014年10月的Plant Physiology的封面,其软件平台2015年11月上线PlantMethods。
具体的测定表型特征可见官方入门手册

操作步骤

首先打开网址
登录界面
选择右上角register或login,需要提供iplant账号。
在上方ROOT下有create root image collection,点击进行创建图片集,然后在图片集中进行上传(upload)
上传图片
然后勾选分析的图像,同时可以点击Calibrate Threshold对图像进行校准,校正完成后会返回图像共目视检验
校正结果

下面是最主要的一步

RSA Trait Computation

首先点击COMPUTATIONS菜单下的CREATE
COMPUTATION创建计算
创建计算
然后可在COMPUTATIONS菜单下的My查看计算结果
自动生成csv文件,可进行下载
数据下载

导出的数据见下方

setwd("C:/Users/Administrator/Desktop")
> library(readxl)
> shuju<-read_xlsx("root.xlsx",sheet = 2)
> shuju
# A tibble: 1,241 x 9
   IMAGE_ID IMAGE_NAME   AREA AVG_DENSITY WIDTH_MED WIDTH_MAX RTP_COUNT ANG_TOP ANG_BTM
      <dbl> <chr>       <dbl>       <dbl>     <dbl>     <dbl>     <dbl>   <dbl>   <dbl>
 1   750867 1-1.jpg    17359        12.0      140.      176.        284    67.6    51.4
 2   750868 1-2.jpg    21682.       11.0      154.      175         376    66.7    48.2
 3   750869 1-3.jpg    22450.       12.0      140.      164.        348    67.6    46.3
 4   750870 2-1.jpg     8121.        8.16      84.3     107.        278    52.5    36.4
 5   750871 2-2.jpg     7346.        4.74      69.4      85.0       213    46.2    29.6
 6   750872 2-3.jpg     7737.        4.06      76.0     107.        312    48.6    32.3
 7   750873 3-1.jpg    13176.        4.52     112.      129.        527    64.0    42.9
 8   750874 3-2.jpg    13344.        6.92     119.      139.        480    62.8    44.4
 9   750875 3-3.jpg    15414.        6.34     108.      121.        422    61.8    40.4
10   750876 5-1.jpg    12223.       11.8      143.      171.        571    67.9    51.5
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搞玉米搞玉米

不同玉米品种根际水解酶的原位研究

写在最前面

这个科研项目是我大二时的urp项目,得到了导师和郝师兄的许多帮助(感谢师兄该我的学术垃圾),基于作者只是一个快乐科研的本科生,如有错误,请您友好地指正。

一、研究目的

根际(rhizosphere)指受根系活动影响的土壤区域,是重要的土壤微生物活性热区,由根系释放释放根系分泌物和其他根际沉积物形成 (Kuzyakov & Blagodatskaya, 2015)。这些根际沉积物可以激活微生物,增加胞外酶合成分泌,导致根际区域的生物化学进程十分剧烈。根际范围可以影响的范围从根表延申到土体土壤,取决于不同土壤养分状况、根系形态结构和根系分泌物的质量和数量酶活性根际热区可以延申到1-3mm (Kuzyakov & Razavi, 2019; Ma et al., 2018; Tian, Razavi, Zhang, Wang, & Blagodatskaya, 2020)。根际区域是植物与土壤交换能量和养分的关键区域,且可以通过调节生物化学反应的强度和范围,以应对外界环境变化。土壤酶是土壤生物化学进程的关键,因此关于植物根际区域酶活性和热区范围的研究具有十分重要意义。
传统的荧光微孔板酶活性检测方法只能通过检测单点的酶活性,而无法真实反应原位土壤酶活性,难以精确区分根际酶活性和非根际酶活性。且该方法在检测过程中,需将土壤制成土壤匀浆,所检测的酶活性包含前期微生物(作物根系)分泌的残留酶,这部分酶被土壤掩蔽,在自然条件下不会显示活性,因而无法区分所测的酶活性是由微生物(植物)对底物添加的响应还是固定在土壤中微生物前期分泌的残留酶活性(Nannipieri et al., 2012)
新兴的酶谱技术可以实现酶活性原位二维显示(Razavi, Zarebanadkouki, Blagodatskaya, & Kuzyakov, 2016),该方法可以测定酶活性在根际的原位分布,已有研究表明不同的根系构型、不同品种、有机肥添加、养分差异和重金属污染以及不同酶之间的根际酶活性热区范围存在显著差异(Ge et al., 2017; Liu et al., 2017; Ma et al., 2019; Wei et al., 2018)
玉米是我国的重要作物,在粮食、能源等方面具有重要的作用,氮肥的投入是玉米持续高产的主要原因(Guo et al., 2010)。随着工业氮肥合成技术推广以来,化学氮肥投入已达到一百年前氮输入的10倍(Canfield, Glazer, & Falkowski, 2010)。过量的N肥投入不仅会导致N肥利用率降低,还会造成环境问题。因此通过育种培育氮高效玉米品种,提高氮肥利用效率对玉米高产稳产,环境保护至关重要。我国在玉米育种方面具有长达数十年的经验,培育出了许多高产高效的玉米品种,而关于高效玉米品种根系如何挖掘土壤养分的是我们所不知的,此研究选取两种玉米品种(郑单958、先玉335),通过酶谱法测定比较两种品种玉米的根际水解酶分布状况。此研究是根际氮高效玉米养分高效吸收的根际-土壤-微生物互作体系研究的一部分,以揭示氮高效玉米根际酶分布如何支持玉米养分利用的高效性,并进一步为根际-土壤-微生物体系的研究提供支持。

二、材料和方法

1.试验设计

选取郑单958与先玉335两个品种,其都为常见的氮高效玉米品种。土壤使用来自农民传统施肥方式的土壤,将土壤过2mm筛后混匀,分为两组,一组不做处理,一组加入氮肥,可以认为本实验存在高氮土壤和不施氮的低氮土壤两个水平。实验共设置两因子、两水平共4个处理,其中每个处理设置3个重复。(图1)

2.播种管理

选取24cm*30cm的根盒,有机玻璃板上附聚酰胺膜,加入事先处理的土壤至根盒重1.2kg,玉米种子经过双氧水消毒后,放置于饱和硫酸钙中浸泡6h后置于湿润滤纸上一个晚上。种植前浇水湿润土壤,将种子放入土壤1cm深,再放入人工气候室中倾斜45°(使得根系与聚酰胺膜玻璃面接触)进行培养。土壤换水率为田间持水量的60%,培养期间通过称重法补水。(图1)
图1.各组处理示意图

3.酶谱测定

酶谱测定选取与碳代谢有关的酶为纤维素酶(BG);与氮代谢有关酶为α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG);与磷代谢有关酶为磷酸酶(AP),其对应底物见表1。培养至20天后进行酶谱分析,拍摄根际酶谱图后根据酶谱图取出根际土与非根际土进行酶活性测定。

类别 底物
与碳代谢有关 纤维素酶(BG) 4-MUF-β-D-xylopyranoside
与氮代谢有关 α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NAG) 4-MUF-β-D-glucopyranoside
与磷代谢有关 磷酸酶(AP) 4-MUF-β-D-Phosphate
与氨基酸代谢有关 亮氨酸氨基肽酶(LAP) L-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin

表1:酶谱分析各种酶对应底物(German et al., 2011)

三、实验结果

1.根盒玻璃板肉眼观察

二十天后观察根盒玻璃板面,观察可见两组施肥处理根系密度远大于未施肥处理,且先玉335(XY335)品种根系密度大于郑单958(ZD958)品种(图2 )
图2:各处理玉米根系状况,a.XY335不施肥处理 b.XY335施肥处理 c.ZD958不施肥处理 d.ZD958施肥处

2.根际酶谱图像

对聚酰胺膜进行拍摄得到的图片(图3),可见施氮处理增加了根际水解酶的活性和范围。且先玉品种较郑丹品种具有更好的根际酶活性与范围,先玉品种更加适应低氮胁迫。
图3是师兄的图,就不放了hhhh

3.酶谱图像灰度值、热区半径分组分析

通过图像处理软件image J (V6.2.4)将像素转化为256位的灰度模式(其中红色灰度为255,对应最高酶活性;蓝色灰度为0,对应最低酶活性),在此基础上减去聚酰胺膜的背景灰度值得到酶谱图数据。观察根际的灰度值在112以上分布,这里人为选取112、128、160作为阈值,通过将各组酶谱图的灰度值将酶活性范围分为酶活性热区(160-255)、中等热区(128-160)、低热区(112-128)三组,得出对应的各组平均灰度与范围半径。
关于NAG酶,所选的三个阈值范围内,处理表现为类似的趋势,均表现为先玉低氮灰度值最高,郑单高氮灰度值最低,且呈现出显著差异。在低氮和高氮条件下,尽管未表现出显著性,可以观察到先玉品种的平均灰度值均高于郑单品种(图4B)。根际热区范围方面,在不同的灰度值阈值区域,高氮条件下的根际热区范围均高于低氮条件,说明低氮条件下的根系活动拓宽了酶活性的范围。另一方面,在低氮条件下,可以观察到郑单品种在给定阈值范围内的热区范围显著大于先玉品种,说明在低氮条件下,郑单品种具有更大的热区范围(图4A)。通过分析可得,郑单与先玉品种在低氮条件下都会通过根系活动增加NAG酶的活性和范围,但同时两个品种的侧重点有所不同,具体表现在先玉品种在酶活性方面更有优势;而郑丹品种更侧重于酶活范围。
图4:A.NAG酶根表不同热区范围半径;B.NAG酶根际平均灰度值。xh:先玉施氮;zh:郑单施氮;xl:先玉低氮;zl:郑丹低氮。每个灰度阈值内进行显著性比较。

LAP酶在所选择的三个阈值范围内,并未呈现出明显显著性差异。在热区半径方面,112-128、128-160的灰度阈值区域呈现出相似趋势,即低氮条件下郑丹品种LAP热区半径较小;而高氮条件下先玉品种LAP酶热区半径较大(图5A)。在灰度值128以上的区域内,高氮与低氮条件下,先玉品种都呈现出更大的热区范围,说明先玉品种可能具备比郑单品种更大的根际区域(图5B)。
图5:A.LAP酶根表不同热区范围半;B.LAP酶根际平均灰度值
在所选择的三个灰度阈值范围内,各处理并未表现出显著性差异,但不同处理呈现出相似趋势,即高氮条件下郑丹根际BG酶活性高于先玉,而在低氮条件下则低于先玉(图6B)。在热区范围方面,高氮条件下,郑单表现出更大的根际热区范围,而在低氮条件下并未表现出显著性(图6A)。
图6:A.BG酶根表不同热区范围半;B.BG酶根际平均灰度

三、讨论

酶是参与土壤有机质降解和土壤养分循环的关键(R. L. Sinsabaugh et al., 2008),随着农业绿色可持续发展观念的兴起,土壤酶指标逐渐被纳入土壤健康的评价指标之一(Cao, Sun, Yang, Sun, & Zhao, 2003)。
此研究中我们发现了玉米品种在根际热区范围与酶活性方面的差异,面对低氮胁迫,先玉335通过增加酶活性,而郑丹通过增加酶热区范围。这种差异体现了玉米品种面对养分胁迫的不同选择策略。增加酶活性可以提高对土壤有机质的矿化程度,增加活性养分供应,而酶活性热区范围的增加,可以在保证确定根系大小的情况下增加养分吸收区域。以往的研究重点主要是酶活性高低,对酶活性热区范围的研究不够。
植物如何通过调节根际酶活性与范围间的平衡是我们所不知的。在一项水稻的根际酶谱研究中便引入了生态学的r对策与k对策的概念加以解释(Wei et al., 2018),快速发展的r对策微生物偏爱于利用简单底物,而k对策微生物更适宜于难降解的底物(如纤维素、木质素)。植物根系具有分泌碳源的能力,刺激根系周围r对策微生物的生长,加速对酶的合成(Spohn & Kuzyakov, 2013),土壤根源碳的含量会随着与根表的距离增加而迅速降低,导致k对策微生物的数量增加,有研究报道在土壤与根系距离增加的情况下,发现了k对策微生物(放线菌)的数量增加(Kawasaki A, 2016),这说明植物可能是通过根系碳源的释放,对根际微生物群落进行调整,进而改变了酶活性与酶活性范围。
酶谱法是近几年新兴的原位酶活性表征技术,分析的结果会受到许多因素的影响,其中底物向土壤的扩散以及成像步骤常常会影响实验结果的准确性。
在背景校正方面,因为聚酰胺膜上其他物质对于光的发射可能会影响酶谱图的拍摄,因此我们使用空白的聚酰胺膜进行背景校正,而事实上许多土壤中的许多有机化合物可以扩散入聚酰胺膜,在紫外光下呈现出荧光(如腐殖质和其他一些重金属元素(Nobuo Watanabe, 2004)),这是本实验所欠缺考虑的。
酶在根系的活性范围扩张受到两个关键过程的影响,分别是酶生产者(主要是微生物)的定殖和活性(Kuzyakov & Blagodatskaya, 2015),以及酶和底物的扩散,其中后者受到碳和养分利用效率的调节(Robert L. Sinsabaugh et al., 2014; Zhu et al., 2018),因此根系酶活性区域的大小在一定程度可能与植物养分利用效率密切相关。在此基础上,我们通过灰度值人为划定的热区范围能否在一定程度上表示根际酶活性区域是一个值得研究的命题。

五、小结

通过土壤酶谱技术使我们能够可视化地研究玉米根际酶活性及其分布,两种玉米品种均可以通过增加酶活性与酶热区范围来适应低氮条件,而两者在面对养分胁迫的不同选择策略存在差异,先玉品种侧重于增加酶活性,促进有机物矿化,而郑丹品种偏向于增加酶活区域来扩大植物养分吸收的范围。基于此实验结论,我们猜测先玉与郑丹品种根际酶活性与范围的差异通过植物根系碳源的分泌加以调控。因此,对植物根际酶活性及其范围的进一步研究是必要的,以挖掘氮高效玉米品种的根际作用机理及其调控机制。

六、参考文献

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写在最后

本实验就存在许多问题和不严谨的地方,其中最最致命的是在灰度阈值范围的选取上,其实关于这方面的文献内容很少,这个阈值范围就是随意确认的。不过这是我大二时的科研训练项目,之后就对分子生物和基因组学感兴趣了,结题之后就没有继续修改了。